이 작품은 제가 데이비스에 Wellcome 트러스트 수석 연구 활동에 의해 지원되었다.

해부 사전에 1. Drosophila 준비 (E. Gavis, 프린스턴 대학교에 따르면) <ol><li> 띄엄띄엄 놓는 병에서 어른을 무시하고 ° C에서 실험에 앞서 25 병을 전송. 새로운 성인 등장하기 시작하면 이틀 기다립니다. </li><li> 고형 식품의 약 10ml를 포함하는 플라이 약병을 가지고 45도 각도에 건조 효모의 0.5-0.7 그램 ​​(표 참조)에 추가합니다. 효모와 플라이 음식의 전체 표면을 덮어서는 안됩니다. </li><li> 하이드 레이트 (그림 1A)에 충분한 효모에 물을 몇 방울을 추가합니다. 45도에서 유리병을 넣고 효모에 대한 약 3 분 물 (그림 1B)에 흠뻑 젖어 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 또는 premix 별도의 용기에 붙여넣은 효모와 주걱으로 유리병에 붙여넣기를 추가합니다. <ol start="4"><li> CO 2 가스를 주입하여 유리병에 파리를 마취. 그들이 계속 움직이게하면 CO 2에 무의식적 파리 팁을 </s정렬 (그림 1C)에 대한 UB 정보&gt; 플라이 패드. </li><li> 미세 스쳐 페인트 브러시 (그림 1D)로 해부 현미경 10-15 암컷하고 원하는 유전자형의 5 수컷을 분리. 남성 claspers의 존재, 그들의 사후에 어두운 튀어나온 구조에 의한 명백한 있습니다. </li><li> yeasted 유리병 (그림 1E)로 선택한 파리를 추가합니다. 24~60시간 25 ° C에서 장소. 중간 단계 달걀 챔버 늦게 무대 달걀 챔버를위한 긴 기간에 대한 젊은이들의 큰 %를 짧은 기간 동안 품어. </li></ol> 2. Drosophila의 난소의 해부 <ol><li> 번호 1.5, 22 X 50mm 커버 슬립 (그림 2A)에서 할로 카본 기름의 작은 방울을 넣으십시오. 그것이 방법으로되지 않습니다쪽으로 준비 커버 슬립을 설정합니다. </li><li> CO 2 패드로 CO 2 가스와 팁을 주입하여 yeasted 사악한에서 파리를 마취. </li><li> (안 일 사이 개인이 복부의 앞부분에서 여성 살찌는 파악하는 날카로운 미세 코의 집게를 사용하여전자 복부 및 흉부) (그림 2B-C). </li><li> 집게와 함께 여성을 잡고 대략 2~3센티미터 준비된 coverslip 위에 해부 현미경으로 볼 수 있습니다. </li><li> 아직도 앞부분에서 개최, 여성의 극단적인 후부 (그림 2D)에서 조직을 제거하는 포셉의 두 번째 세트를 사용합니다. 참고 : 인내심 조직은 보통 사후 엔드와 끄집어 것이다. 포셉에서 제거된 조직을 닦아주십시오. </li><li> 아직 앞부분에서 여성을 누른 상태에서 부드럽게 후부 향해 앞부분에서 근무, 복부를 짠다거나 마사지하는 닦아 포셉을 사용합니다. 튜브의 끝에서 치약을 제거하는 것과 같은 방식으로 복부 마사지. </li><li> 두 개의 커다란 불투명 구조는 집게 (그림 2E-F)의 끝 부분에서 복부와 스틱에서 적용됩니다. 이러한 이점 난소입니다. </li><li> 아래 슬라이드에서 할로 카본 오일에 난소를 만져. </li><li> (Figur coverslip에 기름 4-6 난소 총주고 절개에게 1-2 회 반복E 2G). </li></ol> 3. 격리 ovarioles 참고 : 각 난소는 문자열 10 구슬처럼 배열 여러 단계 중 6-10 에그 챔버로 구성되어 16 대한 ovarioles가 포함되어 있습니다. 참고 : 사전 ovarioles를 격리에 조명이 샘플에 대한 얕은 각도로 치지 않도록, 해부 현미경에 광원을 조정합니다. 이것은 샘플로 명암을 제공하고 젊은 무대 달걀 회의소의 시각화 수 있습니다. <ol><li> 석유에서 닫힌 포셉 (그림 3A)와 후부 끝 (이전 단계)에서 연결 조직을 제거하여 두 개의 난소를 구분합니다. </li><li> 오른쪽에 왼쪽과 젊은 무대에 가장 오래된 단계와 동양은 개인 난소. 난소의 젊은 무대 달걀 챔버 스는 투명하고 난소의 이상 뾰족한 끝부분을 형성하고 있습니다. </li><li> 지배적인 손에 포셉 한 켤레로 부드럽게 기왕이면 일의 잔존물에 의해 난소의 후부를 파악전자 결합 조직. 포셉과 장소에 난소를 누른 상태에서 개별 ovarioles를 (그림 3B-D)을 괴롭혀 (또는 텅스텐 바늘) 해부 프로브를 사용합니다. </li></ol> 참고 : 이전 단계가 전체 난소에서 분리 되 기엔 너무 큰만큼 전문가 ovarioles가 어린 단계 (germarium 10를 위해 얻은) 사이에 깰 것이다. 참고 : 해부 프로브와 함께 늦은 무대 oocyte를 펑쳐링 것은 기름에 누출되는 세포질의 결과 및 개별 ovarioles의 추출이 매우 어려운 것입니다. 늦은 무대 oocyte가 구멍 경우 신선한 난소로 이동합니다. <ol start="4"><li> ovariole은 난소 무료입니다 일단 실험 원하는 방향의 오일 방울과 동양의 중심으로 끌어 해부 프로브를 사용합니다. 참고 : 기름 Ovarioles 정착과 유리를 준수합니다. </li><li> 15-25 개별 ovarioles가 때까지이 과정 (3.3-3.4)을 반복합니다. 주 :이 multip의 절개가 필요할 수 있습니다르 난소. 전체 과정은 15 분 미만 소요됩니다. </li></ol> 참고 : 그것은 오히려 실험을 위해 파리의 N 수를 늘리기 위해 더 적은 파리에서 양쪽 난소를 해부보다는 여러 파리에서 한 난소 각 해부 것이 좋습니다. 참고 : ovariole의 러프 처리는 건강에 해롭습 oocytes 초래할 것이며 실험의 유물로 이어질 수 있습니다. 참고 : Oocytes은 난소 (F로 그림 7E을 비교)에서 해부를 거쳐 40 분 스트레스 때문에 phenotypic 변화를 표시하기 시작합니다. <ol start="6"><li> 일단 ovarioles는 적절한 오리 엔테이션 (그림 3E)에 있으며, 오일의 과잉 난소 조직을 나가 해부 프로브와 닫힌 집게를 사용합니다. 이 자료는 종이 타월에 포셉에서 닦아하실 수 있습니다. </li></ol> 4. 분리 각 늦은 무대 달걀 챔버 (E. Gavis, 프린스턴 대학교에 따르면) <ol><li> domin에 포셉 한 켤레로개미 손이 선호 결합 조직의 잔존물에 의해 격리된 난소의 후부를 파악. 포셉과 장소에 난소를 들고 있지만, 포셉 근처의 난소 (그림 4A)의 뒷부분 끝에 해부 프로브를 소개합니다. 늦은 무대 달걀 챔버 사이에 프로브를 삽입하여 에그 챔버 스를 펑쳐링 피하십시오. </li><li> 초기 단계의 달걀 실 (그림 4B)에서 그것이 종료 때까지 난소를 통해 해부 바늘을 당기세요. 제대로되면 프로브 곳에 ovarioles 늦게 무대 달걀 챔버를 개최 결합 조직을 제거합니다. </li><li> ovarioles가 coverslip에 분산되기 전까지는 4.2 단계를 반복합니다. 주 : 계란 챔버 스가 더 이상 포개진되지 않습니다 때,이 단계가 완료되었습니다. </li><li> 해부 프로브 사용하기 쉬운 영상 (그림 4C)을 허용하도록 후반 oocytes를 구분합니다. </li></ol> 참고 : 늦은 무대 달걀 챔버 스를 해부하면서 oocyte를 펑쳐링 제가 해부 해와 같이 비난은 아냐어린 단계에 대한 ndividual ovarioles. 참고 : 단계 14 달걀 챔버의 경우, 방향에 대한 지느러미 appendages을 파악하기 위해 집게를 사용합니다. 5. 사출 준비 주 : 중간 단계 oocytes의 주입 들어, 동양 ovarioles 수직 커버 슬립의 긴 축합니다. <ol><li> [우리 사건에 적용 정밀에서 DeltaVision 코어]를 이미징 현미경의 전원을 켜고 적절한 이미징 설정 (그림 5A-B)를로드합니다. </li><li> 사출 장치 (그림 5C)를 켭니다. </li><li> 로딩 팁 (그림 5D-E)와 주사 바늘을로드합니다. 주입되는 솔루션은 주사 바늘을 차단할 수 예금을 피하기 위해 고속으로 간단히 centrifuged해야합니다. </li><li> 분사기에 로드된 주입 바늘을 연결합니다. 바늘 (그림 5 층)을 위반하지 않도록주의를 기울입니다. </li><li> unclogging 바늘로 지원하기 위해 잘라내거나 깨진 coverslip에서 유리 2x10 mm의 작은 조각을 배치ovarioles를 포함하는 오일 방울의 t 한쪽. 이 유리 조각을 기름에 덮여 있는지 확인합니다. 이 유리는 바늘을 위반하거나 unclogging에 대해 반대 램 바늘 끝으로 될 것입니다. </li></ol> 6. 형광 RNA의 분사 당신이 시작하기 전에 : 주입 장치 및 주입 바늘이보기의 필드의 중앙 위에 위치하는지와 같은 마이크로 속이는 사람 컨트롤을 설정합니다. <ol><li> 현미경 스테이지에 주입되는 시료를 탑재합니다. </li><li> 20x 목표를 선택합니다. 높거나 낮은 배율의 목표도 사용할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 지점 방문 기능이 자동 스테이지를 사용하는 경우는 주사에 대해 8-9 oocytes 시작하기 전에 모든 단계를 표시하는 것이 좋습니다. 이것은 쉽게 방문하여 선택한 oocytes의 주입을 허용합니다. <ol start="3"><li> 그것이 기름을 만지는 때까지 주입 바늘을 낮춥니다. 객관적인 렌즈를 통해 센터의 바늘 끝. </li><li> 회전실내 조명을 끄고 현미경을위한 밝은 - 그라운드 라이트를 켜십시오. 표시된 지점 목록에서 첫 번째 점 (oocyte)를 선택합니다. oculars을 통해보고 있지만, oocyte (그림 6A)에 중점을 둡니다. </li><li> 그것이 oocyte과 oocyte가 볼 다음과 같은 초점 동일한 비행기에까지 수동으로 바늘을 낮춥니다. </li><li> 그것이 oocyte 내부까지 속이는 사람 컨트롤 사용하여 주사 바늘의 지점을 이동합니다. 빠른 찔러 움직임들은 종종 느린 사전보다 더 성공적이다. 들어가 보니, 바늘에서 작은 볼륨을 추출하고 시각 효과를 평가, 필요에 따라 반복한다. 인젝션이 성공하면이 반복 명백한 아닌 경우, oocyte 내부의 세포질은 드러난 것입니다. 그것은 물질이 주입되었는지 확인하기 위해 형광의 이미지에 필요하지 않습니다. 주사 후, oocyte (그림 6B-G) 내부에서 바늘을 제거합니다. </li><li> 주입 액의 정확한 양은 quantitate하기 어렵습니다. 주입 부피, adju을 높이려면주사 펄스의 압력 또는 시간 ST, 약간 오프닝을 늘리거나 반복 주사 펄스를 사용하는 바늘 끝을 깰. </li></ol> 참고 : 올바르게 실행될 때 전체 사출 공정은 10 초도 소요됩니다. 찔러 또는 oocyte에 바늘 안쪽으로 느린 광범는 계란 챔버에 심한 손상을 것입니다. <ol start="8"><li> 다음에 표시된 oocyte를 선택하기 전에, 그래서 같이 여행 경로에있는 다른 oocytes 연락을하지 않는 기름 주입 바늘 충분히 높지 마련. </li><li> 새로운 oocyte에서 6.6 단계를 반복합니다. 필요한 모든 oocytes가 주입되기 전까지는 이런 방식으로 계속 해. </li></ol> 참고 : 주입하는 동안 실수가 이루어졌다면, 다음 표시된 oocyte로 이동합니다. 손상된 oocytes에 시간을 낭비하지 마십시오. 참고 : needle을 주입 세션 동안 막힌 될 수 있습니다. 이 경우, coverslip에있는 기름에 깨진 유리 조각에 인접한 바늘을 이동합니다. 재치H 동일한 초점 평면에서 유리와 바늘이 부드럽게 유리 (그림 6H)로 바늘을 충돌. 바늘은 사출 버튼을 누르면하고 유체가 종료 바늘의 팁을 경우 확인하여 unclogged되었는지 테스트합니다. <ol start="10"><li> 모든 oocytes가 주입되었을 때, 수동으로 현미경의 빔 경로의 석유와 동양 한번 중에 바늘을 이동합니다. 그것이 눈에 손상을 피하기 위해, 안전한 방향에 있는지 확인합니다. </li></ol> 참고 : 오랜 기간 에그 챔버 고립과 oocyte 분사 사이에 경과된 경우 oocytes 스트레스와 연관된 phenotypic 변화를 주입하고 전시하기 어려울 것입니다. 비슷한 문제 oocyte 또는 과도한 볼륨의 분사 (인물 6I을 비교, J, K)의 거친 취급으로 발생할 수 있습니다. 7. 이미징 실험적인 디자인을하다 <ol><li> 목록에서 첫 번째 주입 oocyte를 선택합니다. 주사는 형광 이미징에서었기 (가 oocyte 내에 것을 시험그림 6G에서들). </li><li> 여기 파장 방출 경로, 여기 시간, Z-스택과 컬렉션 사이의 시간을 포함하여 실험 매개 변수를 구성합니다. 참고 :이에 대한 자세한 내용은 파튼 R., 외를 참조하십시오. (2010) 2. </li><li> 데이터 집합을 수집합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 알렉사-546 grk RNA 합성에서는 체외은 Me31B :: GFP 계란 챔버 (그림 7A)에 주입. RNA는 oocyte의 등 지느러미 앞부분에 localizes하고 핵 주위 캡 (그림 7B)을 형성하고 있습니다. RNA 로컬 라이제이션의 예를 들어 MacDougall N., 외군요. (2003) 11. 형광 표시된 단백질 (타우-GFP, 그림 7C) 또는 RNA 태그 시스템 (grk * mCherry, 그림 7D)을 표현 중순과 하순 무대 oocytes는 주입하지 않고 몇 군데하실 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig1.jpg" /> 1 그림. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig2.jpg" /> 그림 2. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig3.jpg" /> 그림 3. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig4.jpg" /> 4 그림. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig5.jpg" /> 그림 5. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig6.jpg" /> 6 그림. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/3679/3679fig7.jpg" /> 그림 7.

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우리는 공개 할게 없다.

<html> 라이브 세포 이미징은 실시​​간으로 세포 프로세스를 검사를위한 강력한 분석이다. 간단한 명시야 관찰 이외에 단백질과 관심 RNAs에 형광 레이블 외에 많은 혁신으로 리드하고 있습니다. 여기에서 우리는 유전자와 생화학 assays와 함께 활용할 수 이미징 개인 생활 oocytes를위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 실험적으로 주입하여 생활 oocytes를 조작하는 방법에 대해 설명합니다. 직접 RNA 로컬 라이제이션 (배짱과 데이비스되지 않은)과 단백질 6 기능을 억제 항체로 분석에 이차 구조의 능력을 형광 레이블 RNA를 합성에서 체외 포함하여 투입하는 자재에 대한 많은 가능성이 있습니다. 미래의 작품은 가능성이 다른 라벨 구성 요소 및 분자 메커니즘을 테스트할 수 있도록 생활 oocytes에 휴대 기기의 도입을 볼 수 있습니다. T &quot;&gt; 라이브 세포로 작업할 때 조직의 생존과 건강은 필수적입니다. 보존이 프로토콜에서는, 우리는 계란 챔버 스트레스로 이어질 수있는 단계의 번호를 지정하십시오. 예를 들어, 기름 이미징을위한 최상 임에도 불구하고 기름에 확장된 문화가 계란 챔버에 스트레스를 가져올 수 있습니다. 이것은 쉽게 (Figure7F에 그림 7E을 (악센트가없는) 비교 (스트레스 왜곡과 물집됩니다 핵 형태와 위치, oocyte 막을 검사하여 명시야 노출 아래 모니터할 수 있습니다 )) 강조했다. 스테이지는 9 에그 챔버 스는 RNA의 현지화 및 여러 시간 동안 국경 셀 마이 그 레이션 12 보여줍니다. 그러나 단계는 8분의 7 에그 챔버가에서 제거되고있는 난소 중 약 40 분 후에 헤일로 탄소 기름의 병에 효과를 보이기 시작합니다 여성. 늦게 무대 달걀 실, 14 ~ 스테이지 11, 때문에 이러한 단계 13 살이 소낭 세포에서 알 껍질의 분비의 기름이나 수성 매체 중 하나에서 정상적으로 개발할 수 있습니다. 그것은 repo되었습니다수성 곤충 매체에 대한 인슐린의 추가가 6시간 14 germaria까지 14시간 15에 대해 9 단계 oocytes를 유지할 수있는 rted. 그것이 oocytes를 강조하고 생존을 감소로 모든 경우에서, 계란 챔버의 적극적인 책략은 피해야한다. 이미징 계란 실 적은와 치료 돌보는 각각 부드럽게 최적의 생존을 보장하는 가장 좋은 방법입니다.

해부에 사용된 도구는 깨끗한 있어야하지만 autoclaved 할 필요가 없습니다. ETOH와 도구를 닦아주고 시작하기 전에 건조하실 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 파인 스쳐 페인트 브러시 (연예인 검은 담비, 라운드, 크기는 00 또는 0) </td><td> 대부분의 미술 용품​​ 상점에서 구입 </td><td></td><td> 좋은 품질의 브러쉬가 중요하다 </td></tr><tr><td> 할로 카본 제품 공사, 시리즈 95 </td><td> 할로 카본 제품 주식 회사, 887 Kinderkamack 도로, 하천 가장자리 NJ 07661 </td><td></td><td> 유럽​​ 대리점 : Solvadis (GMBH) 석유를 통해 공기를 품어하여 산소를해야합니다. </td></tr><tr><td> 슬립 - 안 가려. 50mm 1.5, 22 X </td><td> 국제-No1-VWR 고양이 = 631-0137-22~50밀리미터 </td><td> Menzel-Glaser-22-40밀리미터-MNJ 400 070T </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 5 호 - Dumostar </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11253-20 </td><td> &quot;Biologie&quot;팁도 잘하지만, 더 약해 </td></tr><tr><td> 프로브를 해부 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 10140-01 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 해부 </td><td> 올림포스 산 </td><td> SZ61 </td><td></td></tr><tr><td> 이산화탄소 패드 </td><td> 를 통해 사용 가능 <a href="http://www.flystuff.com">http://www.flystuff.com</a> / (Genesee 과학의 분할) </td><td> 59-114 (789,060 Dutscher) </td><td> 유럽​​ 대리점 : WWW. dutscherscientific. com</a> / 사용자가 자신의 플라이 패드를 구축 그것은 또한 상대적으로 쉽습니다 </td></tr><tr><td> KimCare </td><td> Kimbery 클라크 - KimCare - 의료 잎사귀 </td><td> KLEW3020 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 - DeltaVision </td><td> 응용 정밀 </td><td> DC-CORE </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Burleigh의 마이크로 루멘 역학 그룹 INC에서. 2260 Argentia 도로, Mississauga, 온타리오, L5N 6H7 캐나다 </td><td> Burleigh PCS-5000 시리즈, TS-5000-300 </td><td> <a href="http://www.ldgi-burleigh.com">http://www.ldgi-burleigh.com</a> / (이전 Exfo) </td></tr><tr><td> 사출 장치 </td><td> Tritech 리서치 주식 회사 2,961 베테랑 번가 로스 앤젤레스, 캘리포니아 90064 </td><td> MINJ-1 </td><td> Eppendorf Femptotips를 위해 홀더에 수정됨 </td></tr><tr><td> 사출 바늘 </td><td> Eppendorf 무균 Femtotips I 및 II </td><td> 930,000,043 </td><td> 다른 팁 여러 애플 리케이션을위한 더 있습니다 </td></tr><tr><td> 팁 20μl로드 </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956.003 </td><td></td></tr><tr><td> 드라이 활성 효모 </td><td> Fleischmann의 효모 </td><td> # 2192 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparing individual drosophila egg chambers for live imaging

라이브 세포 이미징은 축 사양, 세포 분화 및 organogenesis 1과 같은 주제를 조사하기 위해 모델로 사용 Drosophila 조직의 숫자에 적용하는 중요한 기술입니다. 실험 샘플의 올바른 준비는 매우 중요합니다, 종종 무시, 단계입니다. 준비 과정의 목표는 생리 관련을 보장하기 위해 최적의 영상 조건을 확립하는 것입니다. 조직 생존을 유지하기 위해서는 탈수, hypoxia, 과열이나 매체 저하 2를 피하는 것이 중요합니다. Drosophila 계란 챔버 바디 patterning, mRNA의 현지화 및 cytoskeletal 조직 3,4로, 제한된 관련된 질문을 검토하지만위한 잘 구축 시스템입니다. 초기 및 중간 단계 달걀 챔버의 경우 할로 카본 기름에 장착하면 그것이, 산소의 무료 보급을 허용 탈수와 hypoxia 방지 및 현미경을위한 최상의 광학 특성을 가지고 거기에 생존을위한 좋은 것입니다. 임형광 단백질의 노화 것은 계란 챔버 또는 라벨 RNA, 단백질 또는 5-7 항체의 물리적 주입으로 transgenes의 도입을 통해 가능합니다. 예를 들어, 동물의 게놈에 MS2 구조의 첨가 oocyte 8 mRNAs의 실시간 관찰이 가능합니다. 이러한 구조는 코트 단백질 9 MS2 박테리오 파지 RNA의 줄기 루프 상호 작용의 활용을 통해 mRNA의 생체내 라벨에 대해 허용합니다. 여기, 우리는뿐만 아니라 여성의 Drosophila에서 개별 ovarioles와 달걀 회의소를 격리 등 난소의 추출을위한 프로토콜을 제시한다. Drosophila oogenesis 보이고 앨런 C. Spradling (1993, 2009 재판) 10에 대한 자세한 설명하십시오.

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Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

<em&gt; Drosophila</em&gt; 달걀 챔버는 mRNA의 지방화의 메커니즘을 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 지방화의 과정을 버팀목을 대다 역동적인 이벤트를 캡처하기 위해서는 살아있는 조직의 급속한 고해상도 이미지가 필요합니다. 여기서는 절개와 최소한의 중단과 라이브 시료의 이미징을위한 프로토콜을 제시한다.

개별 준비 Drosophila</em라이브 이미징을위한> 계란 회의소

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

19.1K 조회수.  University of Oxford.  Drosophila 달걀 챔버는 mRNA의 지방화의 메커니즘을 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 지방화의 과정을 버팀목을 대다 역동적인 이벤트를 캡처하기 위해서는 살아있는 조직의 급속한 고해상도 이미지가 필요합니다. 여기서는 절개와 최소한의 중단과 라이브 시료의 이미징을위한 프로토콜을 제시한다.

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Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

수확 및 준비 Drosophila</emElectrophysiological 녹화 및 기타 수속을위한> 태아

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

에 GFP-라벨 단백질의 영상을 라​​이브<em&gt; Drosophila</em&gt; Oocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

사멸 세포 간극의 이미지를하는 동안 라이브<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

모자이크 성인의 라이브 이미징 토마토 / GFP-FLP / FRT 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 광 수용체 (photoreceptor)

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

라이브 드로소필라 멜라노가스터 에그 챔버에서 내인성 mRNA 를 시각화하고 추적

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

개별 준비 Drosophila 계란 회의소