Rhodopsin taşıma tahlil yüksek içerik görüntüleme analizi tarafından

Rodopsin yanlış katlama retinitis pigmentosa denilen ilerleyici retina dejenerasyonuna neden olur. Geleneksel görüntüleme yöntemi rodopsin taşımaölçmek için sınırlı kapasiteye sahip olsa da, bu yeni geliştirilen görüntü tabanlı test yanlış pozitif ortadan kaldırarak, yüksek iş elde tarama sağlar. Bu teknik ilaç farmakodinamik hızlı bir değerlendirme sağlar.

Hastalığa neden olan rodopsin katlama kurtarma gözünde, böylece sessizce tedavi edilemez ve kör edici hastalık için bir tedavi potansiyelini hızlandıran, retinitis pigmentosa. Bir membran proteininin hücresel lokalizasyonu işlevi için çok önemlidir. Bu yöntem kolayca değiştirilebilir ve ilgi başka bir membran protein taşıma ölçmek için uygulanır.

Bir plaka haritası hazırladığınızdan ve hücre numarasını ve immüno durum koşullarını hücreler arasında tutarlı tutmak için plakanın her kuyusundan sıvıyı hafifçe ekleyip aspire ettiğinizden emin olun. Bu yüksek bir Z faktörü ve güvenilir sonuçlar verecektir. Başlamak için, tohum 5000 hücreleri iyi siyah duvarlı içine, net alt, poli lizin 384-iyi plaka tedavi.

Plakayı 37 derecede yüzde beş CO2 ile üç saat boyunca hücrelerin plakanın dibine bağlanması için kuluçkaya yatırın. Daha sonra, burada gösterildiği gibi önceden belirlenmiş bir plaka haritasına göre, 5X çalışma çözümleri kuyubaşına 10 mikrolitre eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Şimdi, 22 ve 24 sütunlarına %2 DMSO kuyusu başına 10 mikrolitre ekleyin.

Ayrıca, loş kırmızı ışık altında karanlık bir odada 23 sütun 23 25 mikromolar 9-cis-retinal kuyu başına 10 mikrolitre ekleyin. Tüm çeşitli test bileşiklerinin yüklenmesi bittiğinde, plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Loş kırmızı ışıkta olan karanlık bir odada 384 plakayı çıkar.

Burada, 8 kanallı aspiratör kullanarak, bir vakum toplama şişesine bağlı, nazik plaka kuyularından orta aspire etmek. Daha sonra, tüm 384-iyi plaka için taze hazırlanmış% 4 Paraformaldehit kuyu başına 20 mikrolitre eklemek ve oda sıcaklığında 20 dakika hücreleri düzeltmek için çok kanallı pipet kullanın. Fiksasyondan sonra plakayı normal ışığa yerleştirin.

Orada, her kuyuda Paraformaldehit aspire etmek için 8 kanallı aspiratör kullanın ve PBS kuyubaşına 50 mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanın. PBS'yi toplam üç yıkama döngüsü için aspire edin ve değiştirin. Daha sonra, her kuyuya %5 keçi serumu başına 20 mikrolitre ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, kuyuları aspire ve mililitre B630 anti-rodpsin antikor başına 20 mikrogram 15 mikrolitre ekleyin, 1% keçi serumu sıralı kuyulara A to O.Next, ikincil antikor sadece kontrol grubu için satır P için% 1 keçi serum kuyubaşına 15 mikrolitre ekleyin. 90 dakika veya gece boyunca dört derece santigrat oda sıcaklığında plaka kuluçka. Daha sonra, floroforların fotobeyazmasını önlemek için plakayı alüminyum folyo ile kapatın.

Daha sonra, pbs kuyu başına 50 mikrolitre ile plaka üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS aspire, ve Cy3-konjuge keçi anti-fare IgG antikor mililitre başına beş mikrogram iyi başına 15 mikrolitre ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra tabağı üç kez yıkayın. Daha sonra, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında Hoechst leke mililitre başına bir mikrogram içeren PBS kuyu başına 50 mikrolitre ekleyin. Son olarak, şeffaf bir film ile kuyu plakası mühür, alüminyum folyo ile kaplayın ve bir hafta kadar dört derece santigrat saklayın.

Folyoyu çıkarın ve örnek plakayı plakanın sol üst köşesine A1 yerleştirerek yüksek içerikli bir görüntüleyiciye yerleştirin. Ardından, görüntü edinme parametrelerini ayarlamak için görüntü edinme yazılımını açın. Plaka edinme kurulum penceresini açın ve yeni ayar oluşturun veya varolan bir kurulum dosyasını yükleyin.

20X hedefini seçin ve piksel binning'i iki olarak ayarlayın, böylece kalibre edilmiş piksel boyutu 0,80 x 0,80 mikron olacak. Ardından, tbmktör çizgilerini 2000, görüntü boyutunu site başına 1000 piksel olarak ayarlayın. Ardından, görüntülenecek plaka türünü seçin.

Plaka boyutlarını doldurmak için üretici tarafından sağlanan bilgileri kullanın. Şimdi, kuyu başına görüntülenecek dört site ile birlikte görüntülenecek kuyuları seçin. Aspirasyon ipuçları tarafından dokundu kuyu, yan kaçının.

Görüntüleme için uyarma lazerlerini 405, 488 ve 461 nanometre olarak seçin. Ardından, DAPI, FITC ve Texas Red kanalları için emisyon filtrelerini seçin. Her kanalın lazer gücünü ve kazanımlarını optimize edin, pozitif kontrol kuyularının doygun olmamasını sağlayın.

Otomatik odaklama için iyi odaklamak için iyi seçin. Ardından, edinilecek ilk kuyuyu seçin ve sitenin tüm siteler için otomatik odaklamasını ayarlayın. Ayrıca, her kanal için satır başına dört ortalama seçin ve her kanal için Z-ofset değerini optimize edin.

Doğrulayın, her şey düzgün ayarlanır, ilk plaka köşelerinde iki ila üç kuyu test ederek, görüntüleri tüm test kuyuları için odak olduğundan emin olmak için. Ardından, her sitedeki tüm görüntülerde %40'tan fazla biraraya gelen hücreler olduğunu kontrol edin. Son olarak, tüm kanallardaki floresan yoğunluklarının %100 kontrol kuyularında yaklaşık yarısı doymuş olduğunu kontrol edin.

Ardından, görüntü edinme yöntemini kaydedin ve tüm plakayı çalıştırın. Görüntüleyiciden ayrılmadan önce görüntü kalitesini iki kez kontrol etmek için plakanın ilk sütunundaki görüntüleri yakalamayı bitirene kadar görüntüleyiciyi izleyin. Bittiğinde, plakayı çıkarın ve ileride kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın.

Yüksek içerikli görüntü analizi yazılımı kullanarak görüntü verilerini çekin. Parametreleri ayarlamak için 23 numaralı sütundaki %100 kontrol kuyularından birini seçin. İlk olarak, çözümleme yöntemi olarak çok dalga boyu hücre puanlama seçin ve ek ayarları yapılandırmaya başlayın.

DAPI kanalındaki görüntüleri kullanarak çekirdekleri tanımlayın. Seçilen kuyudaki tanımlı çekirdek şekillerinin çekirdek görüntülerine uygun olduğundan emin olmak için önizleme yapın. Ardından, Rodopsin Venüs'ün görüntülendiği FITC kanalındaki hücre şeklini tanımlayın.

Bunu başarmak için, her hücrenin minimum ve maksimum çaplarını, arka plan üzerinde minimum floresan yoğunluğunu ve her hücrenin minimum alanını ayarlayın. Şimdi, Texas Red kanalındaki rodopsin hücre yüzeyi leke alanlarını, hücre şeklinin minimum ve maksimum çaplarını, arka planın üzerindeki minium floresan yoğunluğunu ve her lekeli hücrenin minimum alanını ayarlayarak tanımlayın. Ayarların en iyi duruma getirilip optimize edilemesini belirlemek için geçerli algoritmayı beş kuyuda test edin.

Ardından, ayarları kaydedin ve yapılandırma penceresini kapatın. Optimize edilmiş analiz yöntemi yle tüm kuyuları çalıştırın. Tamamlandığında, nesne numarasını bozulmamış hücre numarası olarak dışa aktarın.

Rodopsin Venüs yoğunluğu olarak FITC kanalının ortalama yoğunluğunu dışa aktarın ve hücre yüzeyindeRodopin yoğunluğu olarak Teksas Kırmızı Kanalı'nın ortalama yoğunluğunu dışa aktarın. Her parametre için iki renkli ısı eşlemi oluşturmak için elektronik tablo yazılımını kullanın. X ekseninde hücre çizgilerinin adını ve y eksenindeki bileşikleri düzenleyin.

Burada, P23H rodopsin Venüs görüntüleri, yeşil Venüs floresan ifade U2OS hücreleri tedavi ve hücre yüzeyi immün-kırmızı boyama. Hücreler ya DMSO veya beş mikromolar 9-cis-retinal ile tedavi edildi. Rodopsin taşıma tsur, çeşitli koşullar altında tüm hücrede rodopsin miktarı karşılaştırarak, P23H mutant hücre hattında önemli bir iyileşme gösterir, 9-cis-retinal ile tedavi edildiğinde.

Buna ek olarak, hücre yüzeyinde rodopsin yoğunluğu, ve hücre yüzeyinde rodopsin leke oranı tüm hücrede rodopsin Venüs yoğunluğu, P23H mutant için önemli ölçüde daha düşük değildir, DMSO ile tedavi wildtype rodopsin ile karşılaştırıldığında. Isı haritası, birden fazla mutant arasında ortalama rodopsin miktarını ve hücre başına lokalizasyonu karşılaştırmanın etkili bir yoludur. Burada, wildtype kontrolleri ve altı rodopsin mutantları yatay olarak listelenir ve bileşik tedavilerin etkileri dikey olarak karşılaştırılır.

Daha önceki çalışmalara göre hücre yüzeyindeki rodopsin yoğunluğu ve hücre yüzeyindeki rodopsin lekesinin rodopsin Venüs yoğunluğuna oranı, DMSO ile tedavi edilen yabani tipe göre altı mutant için daha düşüktür. Bileşikler bir, iki, altı ve dokuz önemli ölçüde T4R, P23H, D190N ve P267L rodopsin mutantları rodopsin Venüs yoğunluğu için hücre yüzeyinde rodopsin leke oranını artırdı, bu bileşikler plazma membran bu rodopsin mutantların taşınması kurtarma düşündürmektedir. Unutmayın, bu durum görüntü analizi için kritik olduğundan, sabitlemeden önce hücrelerin %50 ile %70 arasında etkili olması gerekir.

Ayrıca, tüm tabak boyunca bir kuyu görüntüleri gösterdi. Odaktaki görüntülerin ve çıkmayan floresan görüntülerin herhangi bir kanal için tüm eşik değerine sahip olduğundan emin olun. Yanlış katlanmış rodopsin naklini kurtaran seçici bileşiklere kadar, bu süreci doğrulayabilir, sonra bu bileşiklerin etkinliğini vivo olarak geçirebiliriz, rodopsin P23H mutantını ifade eden bir fare modeli kullanarak.

Bu yöntem membran protein miktarını ve lokalizasyonunu ölçmemizi sağlar. Bu nedenle, mikro hata için büyük bir araçtır membran protein başına yardımcı kaydetmek ve bozulması başladı. Paraformaldehit, bu deneyde olduğu gibi, bu reaktifin işlenmesini içeren prosedürlere sahiptir.

Kaputun altında yapılacak. Bu reaktifi içeren atıklar tehlikeli bir kimyasal olarak düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.