Kütüphane taraması adı verilen birleştirilmiş sgRNA'mız, genom boyunca kodlamayan elementlerin biyolojik işlevini belirlemek ve değerlendirmek için güçlü bir genetik yaklaşımdır. Bu teknik, ilişkili bağlayıcı bölgeleri, kromatik sınırları veya diğer düzenleyici unsurların hedeflenen genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelememize olanak sağlar. Yaklaşımımız, erken embriyonik gelişimde HOX gen regülasyonunda CTCF, uzun kodlamayan RNA'lar ve arttırıcıların ve anormal HOX gen imzası olan bazı lösemilerin rolünü belirlemek için kullanılabilir.
CtCF bağlama sitelerini hedefleyen bir sgRNA tasarımı ile bu yordamı başlatın. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücre hazırlama da sgRNA kitaplığı klonlama. Lentivirüs paketi için, kotransfect HEK293 T hücreleri saflaştırılmış kütüphane vektörleri 20 mikrogram, paketlenmiş plazmid 15 mikrogram ve zarf plazmid 10 mikrogram, 48 saat boyunca virüsler hasat önce.
48 saat sonra, virüs supernatant toplamak ve 0.45 mikron düşük protein bağlayıcı PVDF membran ile filtre. Daha sonra, konsantre kullanarak, 50 kat lentiviral supernatant konsantre. Aliquot konsantre virüsler ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın.
MOLM13 hücrelerini toplam altı grup için konsantre lentivirus'un çeşitli dozlarıyla karıştırmak için 12 kuyu plakasının ayrı kuyularında çalışın. Hemen 33 santigrat derece iki saat boyunca 1000 kez g bu karışımları santrifüj. 12 kuyu plakasını 4 saat boyunca 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuvöze aktarın.
Hücre paletini bozmadan süpernatant'ı hafifçe aspire edin ve taze takviyeli RPMI 1640 Medium ile transdükre edilmiş hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra yeniden askıya alınan hücreleri T25 şişelerine aktarın ve puromisin olmadan 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra iki şişeye bu hücreleri bölünmüş, beş gün boyunca mililitre püromisin başına bir mikrolitre ile tedavi deneysel bir grup, ve beş gün boyunca puromisin tedavisi olmayan bir kontrol grubu.
Puromisin tedavisi yapılan canlı hücre sayısını puromisin tedavisi olmayan hücre sayısına bölerek transdüksiyon için optimize edilmiş MOI değerini ölçün. Havuzlu kütüphane ile hücreleri iletin, orta sgRNA havuzlu lentivirus 0.3 MOI ile 6 kuyu plaka içinde 1.5 milyon MOLM13 hücreleri enfekte. Bir kontrol olarak lentivirus enfeksiyonu olmadan hücreleri kullanın.
Hücreleri enfekte etmek için 1000 kez g'de altı kuyu plakasını 33 derecede iki saat santrifüj edin. Daha sonra, plakaları 4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecedek kuvöze aktarın. Hücre paletini bozmadan süpernatant'ı hafifçe aspire edin ve transekten hücreleri taze ortamla yeniden askıya alın.
Daha sonra hücreleri T25 şişelerine aktarın ve puromisin olmadan 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, beş gün boyunca mililitre püromisin başına bir mikrogram ile hücreleri tedavi. İki gün sonra taze ortam değişimi ve optimum hücre yoğunluğunu koruyun.
Limitli seyreltme yöntemleri ile 96 iyi plakalar tek klon tohum. Bu tek klonu 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kültür 3-4 hafta boyunca.
SgRNA entegre MOLM13 hücrelerini %0,4 Trypan Blue çözeltisi boyama ile sayın ve daha sonra kuyu başına 10.000 canlı hücreyi 96 iyi pcr plakaya aktarın. Plakayı 1000 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve ardından bir pipetle süpernatantı iyice çıkarın ve atın. Hücre paletini rahatsız etmekten kaçının.
Metinde açıklandığı gibi hücreleri yıkadıktan sonra her kuyuya hücre lisis ana karışımının 50 mikrolitreekleyin. Pipet hücre paletini yeniden askıya almak için beş kez yukarı ve aşağı. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra, karışımı 5 dakika boyunca 37 dereceye, sonra da 5 dakika daha 75 santigrat dereceye aktarın. Rt qPCR reaksiyon karışımını içeren PCR kuyularına bir mikrolitre hücre lisatekleyin. Bu karışım ileri ve ters astar, ters transkriptaz ve Tek Adım reaksiyon karışımı marker genleri içerir.
Ters transkripsiyon reaksiyonunu 50 santigrat derecede 10 dakika çalıştırın ve ardından polimerizasyon aktivasyonu ve 95 santigrat derecede bir dakika DNA denatürasyonu. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 40 döngü PCR reaksiyonu ile RT PCR gerçekleştirin. HOXA9'un sanger dizilimi yoluyla ekspresyon klonlarını azalttığını doğrulayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi MOLM13 genom DNA'sı ile PCR yapın.
PCR arıtma kiti ile PCR ürünlerini ayıklayın ve arındırın. Arınmış PCR ürünlerini T4 ligasyon tamponu, T vektör DNA'sı, PCR DNA'sı ve T4 ligaz ile T vektörüne dönüştürün. Ligasyon karışımını bir gecede 16 derecede bir kuvöze yerleştirin.
Bir LB ampillin antibiyotik agar plaka üzerinde DH5 alfa yetkili hücreleri ve plaka içine ligasyon karışımı aktarın. Tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. LB plakasından tek klonları seçin ve genotipleme ve Sanger sıralama ile doğrulayın.
Referans 200 nanogram ve 0,2 mililitre PCR tüp test PCR amplicons 200 nanogram ile heteroduplex karışım grubu ayarlayın. Kontrol olarak sadece 400 nanogram referans PCR amplicons ile homoduplex karışım grubunu ekleyin. Ayrıca 800 mililitre su ile dolu bir litre likte heteroduplex ve homoduplex karışımı 95 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra karışımları oda sıcaklığına kadar yavaş yavaş soğutarak heteroduplex veya homoduplex'i oluşturabilirsiniz. Şimdi, bir mikrolitre indel mutasyonu algılama nükleazı ile anneleştirilmiş heteroduplex ve homoduplex karışımın 400 nanogramını ve 60 dakika boyunca 42 derecede iki mikrolitre nükleaz reaksiyon tamponu sindirin. Sindirilmiş örnekleri agarose jel elektroforezile analiz edin.
Heteroduplex karışım DNA'sı küçük parçalar halinde kesilmeli ve homoduplex DNA kesilmemelidir. MOLM13 pozitif klonları hedefleyen sgRNA, KONTROL HÜCRELERI ile karşılaştırıldığında HOXA9 genlerinin ekspresyon düzeylerine göre RT qPCR yöntemi ile doğrulandı. Hayatta kalan 528 klondan 10'u HOXA9 seviyelerinde %50'den fazla azalma gösterdi.
hoxa9 azaltılmış entegre sgRNAs, HOXA9 değişmeden ve HOXA9 artmış klonlar, daha fazla sgRNA PCR amplifikasyon ve Sanger dizisi ile kimlik tarafından doğrulandı. HOXA9 seviyelerinde azalma gösteren on klondan altısı, Sanger dizilimi tarafından belirlenen CBS79 bölgesini hedef alan sgRNA'lar içeriyordu. Entegre sgRNA pozitif klonların indel mutasyonları PCR tabanlı genotipleme ve nükleaz sindirimi ile belirlendi.
HOXA7 ve HOXA9 genleri arasında bulunan CTCF sitesinin heterozigot delemesi PCR tabanlı genotipleme ile saptandı. HOXA9-azalmış klonlar beş, altı, 28 ve 121 CBS79 sınır konumunda silme sergiledi. Benzer sonuçlar, nükleaz sindirim tahkikatları ile analiz edilen CBS79 yerindeki indel mutasyonları için de gözlenmiştir.
Bu işlemi gerçekleştirirken, nükleaz sindirim istinat yoluyla sgRNA kaynaklı indel mutasyonları tespit etmek için heteroduplexes ve homoduplexes eşit miktarda yapmak önemlidir. Yaklaşımımız, seçilen işaretleyicinin kullanılmasını, genin lökemogenez üzerindeki etkilerini keşfetmek için hedef gen üzerinde yeni nesil sıralama yapılmasını sağlar. Genel yaklaşımımız, normal biyolojik süreç sırasında dikkat çeken genetik düzensiz elementlerin fonksiyonel olarak doğru lanmasını ve azaltılmasını ve ölümünden sonra genom proje hatasında lökemogenezi nin azaltılmasını önler.
