Unsere gepoolte sgRNA, das Bibliotheksscreening, ist ein leistungsstarker genetischer Ansatz, um die biologische Funktion der nicht kodierenden Elemente im gesamten Genom zu identifizieren und zu bewerten. Diese Technik ermöglicht es uns, die Wirkung der Störung der bindungsstellen assoziierten, chromatischen Grenzen oder andere regulatorische Elemente auf die gezielte Genexpression zu untersuchen. Unser Ansatz kann verwendet werden, um die Rolle von CTCF, langen nicht-kodierenden RNAs und Enhancer, bei der HOX-Genregulation in der frühen embryonalen Entwicklung sowie bestimmter Leukämien mit einer abnormen HOX-Gensignatur zu identifizieren.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Entwurf einer sgRNA, die auf CTCF-Bindungsstellen abzielt. Klonen der sgRNA-Bibliothek in der Zellvorbereitung, wie im Textprotokoll beschrieben. Um das Lentivirus zu verpacken, kotranssektieren HEK293 T-Zellen mit 20 Mikrogramm gereinigter Bibliotheksvektoren, 15 Mikrogramm des verpackten Plasmids und 10 Mikrogramm des Hüllwasserplasmids 48 Stunden vor der Ernte der Viren.
Sammeln Sie nach 48 Stunden den Virusüberstand und filtern Sie ihn durch eine 0,45 Mikrometer-proteinarme PVDF-Membran. Als nächstes konzentrieren Sie den lentiviralen Überstand um das 50-fache, indem Sie den Konzentrator verwenden. Aliquot die konzentrierten Viren und speichern Sie sie in einem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank.
Arbeiten Sie in separaten Brunnen einer 12-Well-Platte, um MOLM13-Zellen mit verschiedenen Dosen des konzentrierten Lentivirus für sechs Gesamtgruppen zu mischen. Diese Mischungen sofort bei 1000-fachg für zwei Stunden bei 33 Grad Celsius zentrieren. Übertragen Sie die 12 Brunnenplatten vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zurück in den Inkubator.
Den Überstand sanft ansaugen, ohne die Zellpalette zu stören, und die transduced Zellen mit frisch ergänztem RPMI 1640 Medium wieder aufhängen. Dann die wieder suspendierten Zellen auf T25-Flaschen übertragen und bei 37 Grad Celsius 48 Stunden ohne Puromycin brüten. Nach 48 Stunden teilten diese Zellen in zwei Kolben, eine experimentelle Gruppe mit einem Mikroliter pro Milliliter Puromycin für fünf Tage behandelt, und eine Kontrollgruppe ohne Puromycin-Behandlung für fünf Tage.
Messen Sie den optimierten MOI-Wert für die Transduktion, indem Sie die Anzahl der mit Puromycin behandelten lebenden Zellen durch die Anzahl der Zellen ohne Puromycin-Behandlung dividieren. Um die Zellen mit der gepoolten Bibliothek zu transducieren, infizieren Sie 1,5 Millionen MOLM13-Zellen in einer 6-Well-Platte mit 0,3 MOI von sgRNA gepooltem Lentivirus im Medium. Verwenden Sie die Zellen ohne die Lentivirus-Infektion als Kontrolle.
Sofort zentrieren Sie die sechs Brunnenplatte bei 1000 mal g für zwei Stunden bei 33 Grad Celsius, um die Zellen zu spritzen. Dann übertragen Sie die Platten zurück zum Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für vier Stunden. Befangen Überstand ansaugen, ohne die Zellpalette zu stören, und die transduced Zellen mit frischem Medium wieder aufhängen.
Dann übertragen Sie die Zellen auf T25-Flaschen und brüten bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden ohne Puromycin. Nach 48 Stunden behandeln Sie die Zellen fünf Tage lang mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Austausch nach frischem Medium nach zwei Tagen und Aufrechterhaltung einer optimalen Zelldichte.
Säen Sie den einzelnen Klon in 96 Brunnenplatten mit begrenzenden Verdünnungsmethoden. Inkubieren Sie diese einzelnen Klon bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Kultur sie für 3-4 Wochen.
Zählen Sie die sgRNA integrierten MOLM13-Zellen mit 0,4%Trypan Blue Lösungsfärbung und übertragen Sie dann 10.000 lebende Zellen pro Brunnen auf eine 96 Well PCR-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 1000 mal g und entfernen Sie den Überstand dann gründlich mit einer Pipette. Vermeiden Sie es, die Zellpalette zu stören.
Nach dem Waschen der Zellen, wie im Text beschrieben, fügen Sie 50 Mikroliter der Zelllyse-Master-Mischung zu jedem Brunnen hinzu. Pipette fünfmal nach oben und unten, um die Zellpalette wieder aufzuhängen. Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Dann übertragen Sie die Mischung auf 37 Grad Celsius für fünf Minuten, und dann 75 Grad Celsius für weitere fünf Minuten. Fügen Sie nun einen Mikroliter Zelllysat in die PCR-Bohrungen ein, die den RT qPCR-Reaktionsmix enthalten. Diese Mischung umfasst die Markergene Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung, Reverse-Transkriptase und One-Step-Reaktionsmix.
Führen Sie die umgekehrte Transkriptionsreaktion 10 Minuten bei 50 Grad Celsius, gefolgt von Polymerisationsaktivierung und DNA-Denaturierung für eine Minute bei 95 Grad Celsius. Führen Sie RT PCR mit 40 Zyklen PCR-Reaktion, wie im Textprotokoll beschrieben. Überprüfen Sie die HOXA9 verminderten Expressionsklone durch Sanger-Sequenzierung und führen Sie PCR mit MOLM13-Genom-DNA durch, wie im Textprotokoll beschrieben.
Extrahieren und reinigen Sie die PCR-Produkte mit dem PCR-Reinigungskit. Ligate die gereinigten PCR-Produkte in den T-Vektor mit T4-Ligationspuffer, T-Vektor-DNA, PCR-DNA und T4-Ligase. Legen Sie die Ligationsmischung über Nacht bei 16 Grad Celsius in einen Brutkasten.
Übertragen Sie die Ligationsmischung in DH5 alpha kompetente Zellen und Platte auf einem LB Ampicillin Antibiotikum Agarplatte. Die Teller über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wählen Sie die einzelnen Klone aus der LB-Platte und verifizieren Sie sie durch Genotypisierung und Sanger-Sequenzierung.
Richten Sie die Heteroduplex-Mischungsgruppe mit 200 Nanogramm der Referenz und 200 Nanogramm Test-PCR-Amplicons in einer 0,2 Milliliter-PCR-Röhre ein. Fügen Sie die Homoduplex-Mischungsgruppe mit nur 400 Nanogramm Referenz-PCR-Amplicons als Steuerung ein. Die Heteroduplex- und Homoduplex-Mischung bei 95 Grad Celsius fünf Minuten lang in einem mit 800 Millilitern Wasser gefüllten Ein-Liter-Becher separat bebrüten.
Dann abkühlen die Mischungen allmählich auf Raumtemperatur zu anneal und bilden die Heteroduplex oder Homoduplex. Nun 400 Nanogramm der geglühten Heteroduplex- und Homoduplex-Mischung mit einem Mikroliter Indelmutationsdetekperund und zwei Mikroliter Nuklease-Reaktionspuffer bei 42 Grad Celsius für 60 Minuten separat verdauen. Analysieren Sie die verdauten Proben mit Agarose-Gel-Elektrophorese.
Die Heteroduplex-Gemisch-DNA sollte in kleine Fragmente geschnitten werden und die Homoduplex-DNA sollte nicht geschnitten werden. sgRNA targeting MOLM13 positive clones wurden mit der RT qPCR Methode bestätigt, basierend auf den Expressionsniveaus von HOXA9-Genen mit dem Vergleich mit den Kontrollzellen. Von den 528 überlebenden Klonen, die gescreent wurden, zeigten 10 Klone eine Reduzierung der HOXA9-Spiegel um mehr als 50 %.
sgRNAs, die in die HOXA9 integriert sind, reduziert, HOXA9 unverändert und HOXA9 erhöhte Klone, wurden durch PCR-Verstärkung der sgRNA und Identifikation durch Sanger-Sequenz weiter bestätigt. Sechs von zehn Klonen, die eine Verringerung der HOXA9-Werte aufweisen, enthielten sgRNAs, die auf die CBS79-Site abzielen, wie durch Sanger-Sequenzierung bestimmt. Indelmutationen integrierter sgRNA-positiver Klone wurden durch PCR-basierte Genotypisierung und Nukleaseverdauung bestimmt.
Die heterozygote Löschung der CTCF-Site zwischen HOXA7 und HOXA9-Genen wurde durch PCR-basierte Genotypisierung identifiziert. Die HOXA9-verringerten Klone fünf, sechs, 28 und 121 zeigten die Löschung an der CBS79-Grenze. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Indelmutationen an der CBS79-Site beobachtet, die durch den Nuklease-Verdauungstest analysiert wurden.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gleiche Mengen an Heteroduplexen und Homoduplexen herzustellen, um sgRNA-induzierte Indelmutationen durch den Nuklease-Verdauungstest zu erkennen. Unser Ansatz ermöglicht die Nutzung des ausgewählten Markers, um eine Sequenzierung der nächsten Generation am Zielgen durchzuführen, um die Auswirkungen des Gens auf die Leukemogenese zu entdecken. Insgesamt verhindert unser Ansatz RPCs zur funktionellen Korrektheit und Reduktion einer festgestellten genetischen unregelmäßigen Elemente während des normalen biologischen Prozesses und Leukemogenese im posthumen Genomprojektfehler.
