Наша объединились sgRNA называется библиотека скрининга, является мощным генетическим подходом для выявления и оценки биологической функции некодирующих элементов по всему геному. Этот метод позволяет нам изучить влияние нарушения связывающих участков, связанных, хроматических границ или других нормативных элементов на целевое выражение генов. Наш подход может быть использован для определения роли CTCF, длинных некодирующих РНК и усилителей, в регуляции генов HOX в раннем эмбриональном развитии, а также некоторых лейкемий с аномальной подписью гена HOX.
Начните эту процедуру с разработки sgRNA ориентации CTCF обязательных сайтов. Клонирование библиотеки sgRNA при подготовке клеток, как описано в текстовом протоколе. Для упаковки лентивируса, cotransfect HEK293 Т-клеток с 20 микрограммами очищенных векторов библиотеки, 15 микрограммов упакованной плазмиды, и 10 микрограммов плазмиды конверта, в течение 48 часов до сбора вирусов.
Через 48 часов соберите супернатант вируса и процберите его через мембрану PVDF с низким содержанием белка мощностью 0,45 микрона. Затем сконцентрировать лентивирусный супернатант в 50 раз, используя концентратор. Aliquot концентрированных вирусов и хранить их в минус 80 градусов по Цельсию морозильник.
Работа в отдельных скважинах 12 пластины скважины для смешивания клеток MOLM13 с различными дозами концентрированного лентивируса для шести общих групп. Немедленно центрифуга эти смеси на 1000 раз g в течение двух часов при 33 градусах по Цельсию. Передача 12 пластин хорошо обратно в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение четырех часов.
Аккуратно аспирировать супернатант, не нарушая клеточной палитры, и вновь приостановить трансдуцированных клеток со свежими дополнены RPMI 1640 Medium. Затем перенесите повторно приостановленные клетки в колбы T25 и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов без пуромицина. После 48 часов разделить эти клетки на две колбы, экспериментальная группа лечение с одним микролитером на миллилитр пуромицин в течение пяти дней, и контрольная группа без лечения пуромицина в течение пяти дней.
Измерьте оптимизированное значение МВД для трансдукции, разделив количество живых клеток, обработанных пуромицином, на количество клеток без лечения пуромицином. Чтобы вывести клетки из сгустиной библиотеки, заразить 1,5 миллиона клеток MOLM13 в 6 хорошо пластины с 0,3 MOI sgRNA объединили лентивирус в среде. Используйте клетки без лентивирусной инфекции в качестве контроля.
Немедленно центрифуга шесть пластин хорошо при 1000 раз g в течение двух часов при 33 градусах по Цельсию, чтобы spinfect клеток. Затем перенесите пластины обратно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислом газе в течение четырех часов. Аккуратно аспирировать супернатант, не нарушая клеточной палитры, и вновь приостановить трансдуцированных клеток со свежей средой.
Затем перенесите клетки в колбы Т25 и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 48 часов без пуромицина. После 48 часов, лечить клетки с одним микрограммом на миллилитр пуромицин в течение пяти дней. Обмен на свежую среду через два дня и поддержание оптимальной плотности клеток.
Семя одного клона в 96 хорошо пластин с ограничением методов разбавления. Инкубировать эти одного клона на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Культура их в течение 3-4 недель.
Подсчитайте sgRNA интегрированные клетки MOLM13 с 0.4%Trypan Голубое окрашивание раствора и после этого перенесите 10.000 живых клеток в наилучшим образом к плите 96 наилучшим образом PCR. Центрифуга пластины в 1000 раз г в течение пяти минут, а затем тщательно удалить и отказаться от супернатанта с пипеткой. Избегайте нарушений клеточной палитры.
После мытья клеток, как описано в тексте добавить 50 микролитров клеток лиза мастер смеси к каждому хорошо. Pipette вверх и вниз пять раз, чтобы вновь приостановить палитру клеток. Инкубировать смесь в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем перенесите смесь до 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем 75 градусов по Цельсию в течение дополнительных пяти минут. Теперь добавьте один микролитр лизата клетки к скважинам ПЦР, содержащим смесь реакции RT qPCR. Эта смесь включает в себя маркер генов вперед и обратной грунтовка, обратная транскриптаза и одношаговая смесь реакции.
Вы запустите обратную реакцию транскрипции в течение 10 минут при 50 градусах по Цельсию с последующим активацией полимеризации и ДНК-денатурации в течение одной минуты при 95 градусах по Цельсию. Выполните RT PCR с 40 циклами реакции ПЦР, как описано в текстовом протоколе. Проверить HOXA9 снижение экспрессии клонов через Сэнгер секвенирования и выполнять ПЦР с ДНК генома MOLM13, как описано в текстовом протоколе.
Извлекайте и очищать продукты ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР. Ligate очищенных продуктов ПЦР в вектор T с буфером перевязки T4, T вектор ДНК, ПЦР ДНК и T4 лигазы. Поместите перевязку смесь в инкубатор при 16 градусов по Цельсию в одночасье.
Передача перевязки смесь в DH5 альфа компетентных клеток и пластины на LB ампициллин антибиотик агар пластины. Инкубировать пластины на ночь при 37 градусах по Цельсию. Выберите одиночные клоны от плиты LB и проверите их genotyping и секвенированием Sanger.
Настройка группы смеси гететеродуплекса с 200 нанограммами эталона и 200 нанограммами испытательных ПЦР ампликонов в 0,2 миллилитровой ПЦР-трубке. Включите homoduplex смесь группы только 400 нанограммов ссылки ПЦР ампликонов в качестве контроля. Отдельно инкубировать гетеродуплексную и гомодуплексную смесь при 95 градусах по Цельсию в течение пяти минут в стакане за один литр, наполненном 800 миллилитров воды.
Затем постепенно охладить смеси до комнатной температуры до аннеальной и сформировать гетеродуплекс или гомодуплекс. Теперь отдельно усваивается 400 нанограммов анеродюмерной гетеродуплексной и гомодуплексной смеси с одним микролитером ядра обнаружения инделявов и двумя микролитров буфера реакции нуклеазы при 42 градусах цельсия в течение 60 минут. Проанализируйте переваренные образцы с помощью электрофорезов агарозного геля.
ДНК гетеродуплексной смеси должна быть разрезана на мелкие фрагменты, а ДНК гомодуплекса не должна быть разрезана. sgRNA ориентации MOLM13 положительные клоны были подтверждены методом RT qPCR, на основе уровня экспрессии генов HOXA9 с сравнением с контрольных клеток. Из 528 сохранившихся клонов, показанных на экране, 10 клонов продемонстрировали более чем 50%-ное снижение уровня HOXA9.
sgRNAs интегрированы в HOXA9 уменьшены, HOXA9 неизменным и HOXA9 увеличение клонов, были дополнительно подтверждены ПЦР усиление sgRNA и идентификации по последовательности Sanger. Шесть из десяти клонов, показывающих снижение уровня HOXA9, содержали sgRNAs, нацеленные на сайт CBS79, как это определено секвенированием Sanger. Индал мутации интегрированных sgRNA положительных клонов были определены на основе ПЦР генотипирования и нуклеазы пищеварения.
Гетерозиготное удаление участка CTCF, расположенного между генами HOXA7 и HOXA9, было выявлено с помощью генотипирования на основе ПЦР. HOXA9-уменьшенные клоны 5, 6, 28 и 121 exhibited deletion в месте граници CBS79. Аналогичные результаты наблюдались для indel мутаций в CBS79 сайт, которые были проанализированы нуклеазы пищеварения анализа.
При выполнении этой процедуры, важно сделать равное количество гетеродуплексов и гомодуплексов для того, чтобы обнаружить sgRNA-индуцированной инделя мутаций через анализ пищеварения нуклеазы. Наш подход позволяет использовать выбранный маркер, проводить секвенирование нового поколения на целевом гене, чтобы обнаружить влияние гена на лейкемогенез. В целом наш подход предотвращает RPC для функциональной коррекции и сокращения отмеченных генетических нерегулярных элементов во время нормального биологического процесса и лейкемогенеза в посмертной ошибке проекта генома.
