Il nostro sgRNA in pool chiamato screening della biblioteca, è un potente approccio genetico per identificare e valutare la funzione biologica degli elementi non di rivestimento in tutto il genoma. Questa tecnica ci consente di esaminare l'effetto di interrompere i siti di legame associati, i confini cromatici o altri elementi regolatori sull'espressione dei geni mirati. Il nostro approccio può essere utilizzato per identificare il ruolo del CTCF, gli RNA e gli esaltatori lunghi non codificanti, nella regolazione genica HOX nello sviluppo embrionale precoce, così come alcune leucemie con una firma genica HOX aberrante.
Iniziare questa procedura con la progettazione di uno sgRNA destinato ai siti di associazione CTCF. Clonazione della libreria sgRNA nella preparazione delle celle come descritto nel protocollo di testo. Per confezionare il lentivirus, cotrasfetto cellule HEK293 T con 20 microgrammi di vettori di libreria purificata, 15 microgrammi del plasmide confezionato e 10 microgrammi del plasmide dell'involucro, per 48 ore prima di raccogliere i virus.
Dopo 48 ore, raccogliere il supernatante virus e filtrarlo attraverso una membrana PVDF legante a basso contenuto proteico da 0,45 micron. Quindi, concentrare il supernatante lentivirale di 50 volte, usando il concentratore. Aliquota i virus concentrati e conservali in un congelatore meno 80 gradi Celsius.
Lavorare in pozzi separati di una piastra di 12 pozza di pozzo per mescolare cellule MOLM13 con varie dosi del lentivirus concentrato per sei gruppi totali. Centrifugare immediatamente queste miscele a 1000 volte g per due ore a 33 gradi celsius. Trasferire le 12 piastre del pozzo nell'incubatrice a 37 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica per quattro ore.
Aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare la tavolozza delle celle e sospendere nuovamente le celle trasdute con RPMI 1640 Medium fresco integrato. Quindi trasferire le cellule ri-sospese su matracci T25 e incubare a 37 gradi celsius per 48 ore senza puromicina. Dopo 48 ore dividere queste cellule in due contenitori, un gruppo sperimentale trattato con un microlitro per millilitro puromicina per cinque giorni e un gruppo di controllo senza puromicina trattamento per cinque giorni.
Misurare il valore MOI ottimizzato per la trasduzione dividendo il numero di cellule vive trattate con puromicina per il numero di cellule senza trattamento con puromicina. Per trasdurre le cellule con la libreria in pool, infettare 1,5 milioni di cellule MOLM13 in una piastra di 6 pozzi con 0,3 MOI di lentivirus in pool di sgRNA in mezzo. Utilizzare le cellule senza l'infezione da lentivirus come controllo.
Centrifugare immediatamente la piastra dei sei pozzi a 1000 volte g per due ore a 33 gradi celsius per spinfect le cellule. Quindi, trasferire le piastre nell'incubatrice a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5% per quattro ore. Aspirare delicatamente il supernatante senza disturbare la tavolozza delle celle e sospendere di nuovo le cellule trasdute con mezzo fresco.
Quindi, trasferire le cellule in matracci T25 e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore senza puromicina. Dopo 48 ore, trattare le cellule con un microgrammo per millilitro puromicina per cinque giorni. Scambiare con mezzo fresco dopo due giorni e mantenere una densità cellulare ottimale.
Seminare il singolo clone in 96 piastre di pozzo con metodi di diluizione limitanti. Incubare questo singolo clone a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica. Culturali per 3-4 settimane.
Contare le celle MOLM13 integrate di sgRNA con colorazione della soluzione Trypan Blue allo 0,4% e quindi trasferire 10.000 cellule vive per pozzo su una piastra PCR da 96 po '. Centrifugare la piastra a 1000 volte g per cinque minuti e quindi rimuovere e scartare accuratamente il supernatante con una pipetta. Evitare di disturbare la tavolozza delle celle.
Dopo aver lavato le cellule come descritto nel testo aggiungere 50 microlitri del mix master di lisi cellulare ad ogni pozzo. Pipetta su e giù cinque volte per sospendere di nuovo la tavolozza delle celle. Incubare il mix per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, trasferire la miscela a 37 gradi Celsius per cinque minuti, quindi 75 gradi Celsius per altri cinque minuti. Ora aggiungete un microlitro di lisato cellulare ai pozzi PCR contenenti la miscela di reazione RT qPCR. Questo mix include i geni marcatori primer avanti e indietro, transcriptasi inversa e mix di reazione one-step.
Eseguire la reazione di trascrizione inversa per 10 minuti a 50 gradi Celsius seguita dall'attivazione della polimerizzazione e dalla denaturazione del DNA per un minuto a 95 gradi celsius. Eseguire RT PCR con 40 cicli di reazione PCR come descritto nel protocollo di testo. Verificare che HOXA9 abbia ridotto i cloni di espressione tramite il sequenziamento Sanger ed eseguire PCR con IL DNA del genoma MOLM13 come descritto nel protocollo di testo.
Estrarre e purificare i prodotti PCR con il kit di purificazione PCR. Legare i prodotti PCR purificati nel vettore T con tampone di legazione T4, DNA vettoriale T, DNA PCR e ligasi T4. Posizionare il mix di legatura in un incubatore a 16 gradi celsius durante la notte.
Trasferire il mix di legatura in cellule e piastre DH5 alpha competenti su una piastra di agar antibiotico di ampicillina LB. Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. Scegli i singoli cloni dalla piastra LB e verificali genotipiando e sequenziando Sanger.
Impostare il gruppo di miscele eteroduplex con 200 nanogrammi del riferimento e 200 nanogrammi di ampliconi PCR di prova in un tubo PCR da 0,2 millilitri. Includere il gruppo di miscele omoduplex con solo 400 nanogrammi di ampliconi PCR di riferimento come controllo. Incubare separatamente la miscela eteroduplex e omoduplex a 95 gradi celsius per cinque minuti in un bicchiere da un litro riempito con 800 millilitri di acqua.
Quindi, raffreddare gradualmente le miscele a temperatura ambiente per ricottura e formare l'eteroduplex o l'omoduplex. Ora, digerire separatamente 400 nanogrammi della miscela eteroduplex e omoduplex ricotta con un microlitro di nucleasi di rilevamento delle mutazioni indelebili e due microlitri di tampone di reazione della nucleasi a 42 gradi celsius per 60 minuti. Analizzare i campioni digeriti con elettroforesi del gel di agarosio.
Il DNA della miscela eteroduplex deve essere tagliato in piccoli frammenti e il DNA omoduplex non deve essere tagliato. sgRNA mirato a cloni positivi MOLM13 sono stati confermati con il metodo RT qPCR, basato sui livelli di espressione dei geni HOXA9 con il confronto con le cellule di controllo. Dei 528 cloni sopravvissuti proiettati, 10 cloni hanno mostrato una riduzione di oltre il 50% dei livelli HOXA9.
gli sgRNA integrati nell'HOXA9 ridotti, HOXA9 invariati e HOXA9 cloni aumentati, sono stati ulteriormente confermati dall'amplificazione PCR dello sgRNA e dall'identificazione con la sequenza Sanger. Sei dei dieci cloni che mostravano una riduzione dei livelli di HOXA9 contenevano sgRNA destinati al sito CBS79, come determinato dal sequenziamento di Sanger. Le mutazioni indelebili dei cloni positivi dello sgRNA integrato sono state determinate dalla genotipizzazione basata sulla PCR e dalla digestione della nucleasi.
La cancellazione eterozigote del sito CTCF situato tra i geni HOXA7 e HOXA9 è stata identificata dal genotipizzazione basato su PCR. I cloni ridotti da HOXA9 cinque, sei, 28 e 121 hanno mostrato la cancellazione nella posizione limite cbs79. Risultati simili sono stati osservati per le mutazioni indelebili nel sito CBS79 che sono state analizzate dal saggio di digestione della nucleasi.
Quando si esegue questa procedura, è importante fare uguali quantità di eteroduplexes e omoduplex al fine di rilevare mutazioni indeleli indotte da sgRNA attraverso il saggio di digestione della nucleasi. Il nostro approccio consente l'utilizzo del marcatore selezionato, per effettuare il sequenziamento di nuova generazione sul gene bersaglio per scoprire gli effetti del gene sulla leucemogenesi. Nel complesso il nostro approccio previene le RPC per il corretto funzionale e la riduzione di un noto elementi genetici irregolari durante il normale processo biologico e la leucemogenesi nell'errore del progetto genoma postumo.
