Nosso sgRNA agrupado chamado de triagem da biblioteca, é uma poderosa abordagem genética para identificar e avaliar a função biológica dos elementos não codificados em todo o genoma. Esta técnica nos permite examinar o efeito de interromper os locais de ligação associados, limites cromáticos ou outros elementos regulatórios na expressão de genes direcionados. Nossa abordagem pode ser usada para identificar o papel do CTCF, RNAs e enhancers não codificantes de longa duração, na regulação genética HOX no desenvolvimento embrionário precoce, bem como certas leucemias com uma assinatura genética hox aberrante.
Inicie este procedimento com o desenho de um sgRNA direcionado aos locais de vinculação CTCF. Clonagem da biblioteca sgRNA na preparação celular, conforme descrito no protocolo de texto. Para embalar o lentivírus, cotransfectam células HEK293 T com 20 microgramas de vetores de biblioteca purificados, 15 microgramas do plasmídeo embalado e 10 microgramas do plasmídeo envelope, por 48 horas antes de colher os vírus.
Após 48 horas, colete o vírus supernadante e filtre-o através de uma membrana PVDF de ligação de baixa proteína de 0,45 mícade. Em seguida, concentre o supernatante lentiviral em 50 vezes, usando o concentrador. Aliquot os vírus concentrados e armazene-os em um freezer de menos 80 graus celsius.
Trabalhe em poços separados de uma placa de 12 poços para misturar células MOLM13 com várias doses do lentivírus concentrado para seis grupos totais. Imediatamente centrifugar essas misturas a 1000 vezes g por duas horas a 33 graus celsius. Transfira as 12 placas do poço de volta para a incubadora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro horas.
Aspire suavemente o supernaente sem perturbar a paleta celular, e suspenda as células transduzidas com RPMI 1640 Médio complementado fresco. Em seguida, transfira as células re-suspensas para frascos T25 e incubar a 37 graus celsius por 48 horas sem puramicina. Após 48 horas dividindo essas células em dois frascos, um grupo experimental tratado com um microliter por mililitro puromicina por cinco dias, e um grupo controle sem tratamento de puramicina por cinco dias.
Meça o valor otimizado do MOI para transdução, dividindo o número de células vivas tratadas com puramicina pelo número de células sem tratamento de puramicina. Para transduzir as células com a biblioteca agrupada, infecte 1,5 milhão de células MOLM13 em uma placa de 6 poços com 0,3 MOI de lentivírus agrupado sgRNA em médio. Use as células sem a infecção por lentivírus como controle.
Imediatamente centrifufique a placa de seis poços a 1000 vezes g por duas horas a 33 graus celsius para girar as células. Em seguida, transfira as placas de volta para a incubadora a 37 graus celsius em 5% de dióxido de carbono por quatro horas. Aspirar suavemente o supernaente sem perturbar a paleta celular, e suspender re-suspender as células transduzidas com meio fresco.
Em seguida, transfira as células para frascos T25 e incubar a 37 graus celsius por 48 horas sem puramicina. Após 48 horas, trate as células com um micrograma por mililitro puromicina por cinco dias. Troque por meio fresco após dois dias e mantenha uma densidade celular ótima.
Semente o único clone em 96 placas de poço com métodos de diluição limitantes. Incubar estes clones únicos a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. Cultuá-los por 3-4 semanas.
Conte as células MOLM13 integradas sgRNA com coloração de solução Trypan Blue de 0,4% e, em seguida, transfira 10.000 células vivas por poço para uma placa PCR de 96 poços. Centrifugar a placa a 1000 vezes g por cinco minutos e, em seguida, remova completamente e descarte o sobrenatante com uma pipeta. Evite perturbar a paleta de celular.
Depois de lavar as células como descrito no texto adicione 50 microliters da mistura mestre da lise celular a cada poço. Pipeta para cima e para baixo cinco vezes para suspender a paleta de celular. Incubar a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, transfira a mistura para 37 graus celsius por cinco minutos e, em seguida, 75 graus celsius por mais cinco minutos. Agora adicione um microliter de lise celular aos poços PCR contendo a mistura de reação RT qPCR. Esta mistura inclui os genes marcadores para frente e primer reverso, transcriptase reversa e mix de reação One-Step.
Execute a reação de transcrição reversa por 10 minutos a 50 graus celsius seguido de ativação de polimerização, e desnaturação de DNA por um minuto a 95 graus celsius. Execute o RT PCR com 40 ciclos de reação pcr conforme detalhado no protocolo de texto. Verifique os clones de expressão rompidos hoxa9 através do sequenciamento Sanger e execute PCR com DNA de genoma MOLM13, conforme descrito no protocolo de texto.
Extrair e purificar os produtos PCR com o kit de purificação PCR. Ligate os produtos PCR purificados no vetor T com tampão de ligadura T4, DNA vetorial T, DNA PCR e ligadura T4. Coloque a mistura de ligadura em uma incubadora a 16 graus celsius durante a noite.
Transfira a mistura de ligadura para células competentes DH5 alfa e placa em uma placa de agar antibiótico de ampicillina LB. Incubar as placas durante a noite a 37 graus celsius. Escolha os clones únicos da placa LB e verifique-os por genotipagem e sequenciamento Sanger.
Configure o grupo de mistura heteroduplex com 200 nanogramas da referência, e 200 nanogramas de amplicons pcr de teste em um tubo PCR de 0,2 mililitro. Inclua o grupo de mistura homoduplex com apenas 400 nanogramas de amplicons pcr de referência como controle. Incubar separadamente a mistura heteroduplex e homoduplex a 95 graus celsius por cinco minutos em um béquer de um litro cheio com 800 mililitros de água.
Em seguida, esfrie as misturas gradualmente até a temperatura ambiente para ressarcer e formar o heteroduplex ou homoduplex. Agora, digera separadamente 400 nanogramas da mistura heteroduplex e homoduplex com um microliter de nuclease de detecção de mutação indel, e dois microliters de tampão de reação nuclease a 42 graus celsius por 60 minutos. Analise as amostras digeridas com eletroforese de gel agarose.
O DNA da mistura heteroduplex deve ser cortado em pequenos fragmentos e o DNA homoduplex não deve ser cortado. sgRNA direcionados aos clones positivos MOLM13 foram confirmados com o método RT qPCR, baseado nos níveis de expressão dos genes HOXA9 com a comparação com as células de controle. Dos 528 clones sobreviventes exibidos, 10 clones apresentaram redução de mais de 50% nos níveis de HOXA9.
sgRNAs integrados à redução hoxa9, hoxa9 inalterado e hoxa9 aumento de clones, foram ainda confirmados pela amplificação PCR do sgRNA e identificação por sequência Sanger. Seis dos dez clones que mostram uma redução nos níveis de HOXA9 continham sgRNAs visando o site CBS79, conforme determinado pelo sequenciamento de Sanger. Mutações indel de clones positivos sgRNA integrados foram determinadas por genotipagem baseada em PCR e digestão de nuclease.
A exclusão heterozigous do local CTCF localizado entre os genes HOXA7 e HOXA9 foi identificada por genotipagem baseada em PCR. Os clones reduzidos de HOXA9 cinco, seis, 28 e 121 exibiram exclusão no local de fronteira cbs79. Resultados semelhantes foram observados para as mutações inde no local CBS79 que foram analisadas pelo ensaio de digestão nuclease.
Ao realizar este procedimento, é importante fazer quantidades iguais de heteroduplexos e homoduplexes, a fim de detectar mutações indelédas induzidas pelo SGRNA através do ensaio de digestão nuclease. Nossa abordagem permite a utilização do marcador selecionado, para realizar sequenciamento de próxima geração no gene alvo para descobrir os efeitos do gene na leukemogênese. Em geral, nossa abordagem impede rpc's para o correto funcional e redução de um notável elemento genético irregular durante o processo biológico normal e leukemogenesis no erro do projeto genoma póstumo.
