لدينا sgrna مجمعة تسمى فحص المكتبة، هو نهج وراثي قوي لتحديد وتقييم الوظيفة البيولوجية للعناصر غير المكدّس في جميع أنحاء الجينوم. هذه التقنية تسمح لنا بفحص تأثير تعطيل المواقع الملزمة المرتبطة بها ، والحدود اللونية أو العناصر التنظيمية الأخرى على التعبير الجيني المستهدف. ويمكن استخدام نهجنا لتحديد دور CTCF، RNAs طويلة غير الترميز و القدرة على، في تنظيم الجينات HOX في التنمية الجنينية في وقت مبكر، فضلا عن بعض اللوكيميا مع توقيع الجينات HOX منحرفة.
ابدأ هذا الإجراء بتصميم sgRNA استهداف مواقع الربط CTCF. استنساخ مكتبة sgRNA في إعداد الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. لحزمة فيروس العدس، cotransfect HEK293 الخلايا T مع 20 ميكروغرام من ناقلات المكتبة النقية، 15 ميكروغرام من بلازميد المعبأة، و 10 ميكروغرام من plasmid المغلف، لمدة 48 ساعة قبل حصاد الفيروسات.
بعد 48 ساعة، وجمع الفيروس فائقة وتصفية من خلال 0.45 ميكرون منخفضة البروتين ملزمة غشاء PVDF. بعد ذلك ، ركز الناظر من قبل 50 مرة ، باستخدام المكثف. Aliquot الفيروسات المركزة وتخزينها في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية.
العمل في آبار منفصلة من 12 بئرا لخلط خلايا MOLM13 مع جرعات مختلفة من مركزة من فيروس العدس لست مجموعات مجموع. فورا الطرد المركزي هذه الخلائط في 1000 مرات ز لمدة ساعتين في 33 درجة مئوية. نقل 12 لوحة البئر مرة أخرى إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات.
pirate بلطف عظمى دون إزعاج لوحة الخلية، وإعادة تعليق الخلايا العابرة مع جديدة تكمل RPMI 1640 المتوسطة. ثم نقل الخلايا التي أعيد تعليقها إلى قارورة T25 واحتضانها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة بدون البوسوميسين. بعد 48 ساعة تقسيم هذه الخلايا إلى قارورة اثنين، مجموعة تجريبية تعامل مع ميكرولتر واحد لكل بوروميسين المليلتر لمدة خمسة أيام، ومجموعة مراقبة دون علاج البوريميسين لمدة خمسة أيام.
قياس قيمة وزارة الداخلية الأمثل لtransduction بقسمة عدد الخلايا الحية تعامل مع البوسوميسين على عدد من الخلايا دون علاج البوروميسين. لنقل الخلايا مع المكتبة المجمعة، تصيب 1.5 مليون خلية MOLM13 في لوحة 6 بئر مع 0.3 MOI من sgRNA تجمعت فيروس العدس في المتوسط. استخدام الخلايا دون عدوى فيروس العدس كمكافحة.
فورا الطرد المركزي لوحة 6 جيدا في 1000 مرات ز لمدة ساعتين في 33 درجة مئوية لتدور الخلايا. ثم، نقل لوحات العودة إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات. pirnatate بلطف عظمى دون إزعاج لوحة الخلية، وإعادة تعليق الخلايا العابرة مع المتوسطة الطازجة.
ثم، نقل الخلايا إلى قارورة T25 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة دون البوريميسين. بعد 48 ساعة، علاج الخلايا مع ميكروغرام واحد لكل المليلتر بوروميسين لمدة خمسة أيام. تبادل لوسيلة جديدة بعد يومين والحفاظ على كثافة الخلية المثلى.
بذور استنساخ واحد في 96 لوحات جيدا مع أساليب التخفيف الحد. احتضان هذه استنساخ واحد في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثقافة لهم لمدة 3-4 أسابيع.
عد الخلايا MOLM13 SGRNA المتكاملة مع 0.4٪ Trypan الأزرق حل تلطيخ ومن ثم نقل 10، 000 الخلايا الحية في بئر إلى 96 جيدا لوحة PCR. الطرد المركزي لوحة في 1000 مرات ز لمدة خمس دقائق ثم إزالة تماما وتجاهل الملوحة مع الماصات. تجنب إزعاج لوحة الخلية.
بعد غسل الخلايا كما هو موضح في النص إضافة 50 ميكرولترات من الخلية المزيج الرئيسي لتحلل إلى كل بئر. الماصات صعودا وهبوطا خمس مرات لإعادة تعليق لوحة الخلية. احتضان المزيج لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم، نقل الخليط إلى 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إضافية. الآن إضافة ميكرولتر واحد من lysate الخلية إلى آبار PCR التي تحتوي على مزيج رد فعل QPCR RT. ويشمل هذا المزيج الجينات علامة إلى الأمام وعكس التمهيدي، النسخ العكسي ومزيج رد فعل خطوة واحدة.
تشغيل رد فعل النسخ العكسي لمدة 10 دقائق في 50 درجة مئوية تليها تنشيط البلمرة، والحمض النووي-denaturation لمدة دقيقة واحدة في 95 درجة مئوية. تنفيذ RT PCR مع 40 دورات من تفاعل PCR كما هو مفصل في بروتوكول النص. تحقق من استنساخ التعبير المتناقص HOXA9 خلال تسلسل Sanger وتنفيذ PCR مع الحمض النووي الجينوم MOLM13 كما هو موضح في بروتوكول النص.
استخراج وتنقية منتجات PCR مع مجموعة تنقية PCR. Ligate منتجات PCR المنقاة في متجه T مع T4 العازلة الربط، T ناقلات الحمض النووي، PCR الحمض النووي و T4 ligase. ضع مزيج الربط في حاضنة عند 16 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
نقل مزيج الربط في خلايا DH5 ألفا المختصة ولوحة على LB أمبيسيلين المضادات الحيوية agar لوحة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. اختيار استنساخ واحد من لوحة LB والتحقق منها عن طريق genotyping وتسلسل سانجر.
إعداد مجموعة خليط heteroduplex مع 200 نانوجرام من المرجع، و 200 نانوغرام من اختبار PCR amplicons في أنبوب PCR 0.2 ملليلتر. وتشمل مجموعة خليط هدوبليكس مع 400 نانوغرام فقط من ابرليكونات PCR المرجعية كتحكم. بشكل منفصل احتضان خليط غيريدولبليكس وهدوبليكس في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في الكوابر لتر واحد مليئة 800 ملليلتر من الماء.
ثم، تبرد المخاليط تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة إلى الوَلَس وتشكيل المتغاير أو هُمودبليكس. الآن، هضم بشكل منفصل 400 نانوغرام من الخليط المتين المتدلي وخليط هدوبليكس مع ميكرولتر واحد من نواة اكتشاف الطفرات إنديل، واثنين من ميكرولترات من عازلة تفاعل النوى في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تحليل العينات المهضوية مع agarose هلام الكهرباء.
وينبغي قطع الحمض النووي خليط heteroduplex إلى أجزاء صغيرة وينبغي عدم قطع الحمض النووي المتجانس. تم تأكيد استهداف الحمض SGRNA MOLM13 الإيجابي باستخدام طريقة RT qPCR ، استنادًا إلى مستويات التعبير من جينات HOXA9 مع المقارنة مع خلايا التحكم. من أصل 528 استنساخ على قيد الحياة فحص، 10 استنساخ أظهرت أكثر من 50٪ تخفيض في مستويات HOXA9.
SgRNAs دمجها في HOXA9 تخفيض، HOXA9 دون تغيير وHOXA9 زيادة استنساخ، وأكد كذلك عن طريق تضخيم PCR من SGRNA وتحديد بواسطة تسلسل سانجر. ستة من أصل عشرة مستنسخين تظهر انخفاضا في مستويات HOXA9 تحتوي على sgRNAs تستهدف موقع CBS79 ، على النحو الذي يحدده تسلسل سانجر. تم تحديد طفرات Indel من النسخ المدمجة SgRNA الإيجابية بواسطة genotyping المستندة إلى PCR وهضم النوى.
تم تحديد حذف غيريوزيغو لموقع CTCF الموجود بين جينات HOXA7 وHOXA9 بواسطة جينوتيبينغ القائم على PCR. وقد أظهرت عمليات النسخ المتناقصة من HOXA9 الحذف في موقع الحدود CBS79 خمسة وستة و28 و121. ولوحظت نتائج مماثلة لطفرات إنديل في موقع CBS79 التي تم تحليلها من قبل فحص هضم النوى.
عند إجراء هذا الإجراء ، من المهم إجراء كميات متساوية من الهاتيرودوليكس وتجانسدبليبس من أجل الكشف عن طفرات إنديل التي يسببها الحمض النووي من خلال فحص هضم النوى. نهجنا تمكن من الاستفادة من علامة مختارة، لتنفيذ الجيل التالي التسلسل على الجين المستهدف لاكتشاف آثار الجين على تكوين الكريات البيض. عموما نهجنا يمنع RPC لتصحيح وظيفية والحد من العناصر الوراثية غير النظامية لاحظت خلال العملية البيولوجية العادية و الكريات البيض في خطأ مشروع الجينوم بعد وفاته.
