公司重点调查的社区图书馆筛选确定关键 CTCF 边界

我们的池sgRNA称为库筛选，是一种强大的遗传方法，用于识别和评估整个基因组中非编码元素的生物功能。这种技术使我们能够检查破坏相关结合位点、色边界或其他调控元素对靶向基因表达的影响。我们的方法可用于识别CTCF，长非编码RNA和增强剂的作用，在早期胚胎发育HOX基因调控中的作用，以及某些具有异常HOX基因特征的白血病。

从针对 CTCF 绑定位点设计的 sgRNA 开始此过程。在细胞制备中克隆sgRNA库，如文本协议中所述。为了包装扁病毒，用20微克的纯化库载体、15微克的包装质粒和10微克的包络质粒，在采集病毒前48小时进行共传递 HEK293 T细胞。

48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45微米低蛋白结合PVDF膜进行过滤。接下来，使用浓缩器将扁病毒上经剂集中50倍。将浓缩病毒储存在零下80摄氏度的冰柜中。

在12孔板的单独井中工作，将MOLM13细胞与各种剂量的浓缩扁病毒混合，共6组。立即将这些混合物以1000倍g离心，在33摄氏度下进行两小时。将12个井板在37摄氏度和5%的二氧化碳下将转回孵化器4小时。

轻轻吸吸上一提液，而不干扰细胞调色板，并重新悬浮带新鲜补充的RPMI 1640中等的换能细胞。然后将重新悬浮的细胞转移到T25烧瓶中，在37摄氏度下孵育48小时，不产生紫霉素。48小时后，这些细胞分成两个烧瓶，一个实验组用每毫升一微升的紫菜素治疗5天，一个对照组5天不进行紫辛治疗。

通过将用紫霉素治疗的活细胞数除以不进行普霉素治疗的细胞数，测量优化的MOI值。要通过池库对细胞进行转导，在6井板中感染150万个MOLM13细胞，在介质中感染0.3 MOI的sgRNA池扁病毒。使用没有扁病毒感染的细胞作为控制。

立即将六个井板以1000倍g离心，在33摄氏度下两小时旋转细胞。然后，将板在摄氏37度的5%二氧化碳中转移回孵化器4小时。在不干扰细胞调色板的情况下轻轻吸进上一提液，用新鲜介质重新悬浮转导细胞。

然后，将细胞转移到T25烧瓶中，在37摄氏度下孵育48小时，不产生霉素。48小时后，用每毫升一微克的紫菜素治疗细胞5天。两天后交换新鲜介质，并保持最佳的细胞密度。

用限制稀释方法在96个井板中播种单克隆。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育这些单克隆。培养他们 3 - 4 周。

计算 sgRNA 集成 MOLM13 细胞与 0.4% Trypan Blue 溶液染色，然后将每井 10，000 个活细胞转移到 96 井 PCR 板。将板以 1000 次 g 离心五分钟，然后用移液器彻底取出和丢弃上清液。避免干扰单元格调色板。

洗涤后，如文本中描述的，将50微升的细胞解解主混合添加到每个井中。上下移位五次以重新挂起单元格调色板。在室温下孵育混合物10分钟。

然后，将混合物转移到37摄氏度5分钟，然后将75摄氏度再转5分钟。现在向含有RT qPCR反应混合物的PCR孔中加入一微升的细胞来亚酸盐。这种混合物包括标记基因向前和反向底转，逆转录酶和一步反应混合。

在50摄氏度下运行逆转录反应10分钟，然后聚合激活，DNA变性在95摄氏度下运行1分钟。执行RT PCR 与 40 周期的 PCR 反应，如文本协议中详细说明。验证HOXA9通过桑格测序减少的表达克隆，并执行PCR与MOLM13基因组DNA如文本协议所述。

使用 PCR 纯化套件提取和纯化 PCR 产品。使用 T4 结扎缓冲液、T 向量 DNA、PCR DNA 和 T4 连接酶将纯化 PCR 产品放入 T 向量中。将结扎混合物放入16摄氏度的孵化器中过夜。

将结扎混合物转移到 DH5 alpha 能力细胞和 LB 安西林抗生素加糖板上的板中。在37摄氏度下孵育板。从 LB 板中选取单个克隆，然后通过基因分型和桑格测序进行验证。

在 0.2 毫升 PCR 管中设置具有 200 毫微克的异质混合物组，以及 200 毫微克的测试 PCR amplicons。包括仅含有 400 纳米的参考 PCR 安普利森的同性混合物组作为控制。在充满800毫升水的一升烧杯中，在95摄氏度下单独孵育杂合和同质混合物，5分钟。

然后，将混合物逐渐冷却至室温至退火，形成异质或同性。现在，用一微升的英德尔突变检测核酸酶和两个微升的核酸酶反应缓冲液，在42摄氏度下分别消化400纳米的退火杂质和同质复性混合物，60分钟。使用阿加罗斯凝胶电泳分析消化的样品。

异质混合物DNA应切割成小片段，同质DNA不应切割。基于HOXA9基因的表达水平与对照细胞的比较，用RT qPCR方法确认了针对MOLM13阳性克隆的sgRNA。在筛选的528个存活克隆中，有10个克隆在HOXA9水平上表现出50%以上的降幅。

与HOXA9集成的sgRNA减少，HOXA9不变，HOXA9增加克隆，进一步通过PCR扩增sgRNA和桑格序列的鉴定得到进一步确认。在显示HOXA9水平降低的10个克隆中，有6个包含针对CBS79站点的sgRNA，由桑格测序确定。集成sgRNA阳性克隆的内德尔突变由基于PCR的基因分型和核酸酶消化确定。

位于HOXA7和HOXA9基因之间的CTCF位点的异质缺失由基于PCR的基因分型识别。HOXA9 减少的克隆 5、6、28 和 121 在 CBS79 边界位置显示删除。通过核酸酶消化分析分析的CBS79位点内突变也观察到类似的结果。

执行此程序时，重要的是使等量的异质复性与同性，以便通过核酸酶消化分析检测 sgRNA 诱导的内德尔突变。我们的方法能够利用选定的标记，对目标基因进行下一代测序，以发现该基因对白血病生成的影响。总的来说，我们的方法可以防止RPC在正常生物过程中对著名的遗传不规则元素进行功能校正和减少，并在死后基因组计划误差中减少白血病。