RNA düzenlemesi insan hastalığında kritik bir rol oynamaktadır. Bilim adamları ilaçlarda sonsuz uygulama alanı buluyorlar. Bu protokol, doğrudan RNA dizilemesine gerek kalmadan RNA düzenlemede RNA modifikasyonunun hızlı ve güvenilir bir şekilde tanımlanması için dizilemesiz bir yaklaşım olarak taşınabilir sıcaklık elektroforezi teknolojisinin uygulanmasını göstermektedir.
Mikro tTG elektroforez tabanlı yaklaşım, dört düzenlenmiş RNA fragmanının erime profili ile bunlara karşılık gelen düzenlenmemiş fragmanlar arasındaki farkları karakterize etmek için kullanılmıştır. Örüntü benzerlik puanları, yöntemin tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için kullanıldı. Bu platform, RNA'larda tek tabanlı ikamenin bile basit, basit ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesini sağlar.
Bu analitik aracın moleküler biyolojide yeni bulgulara yardımcı olacağı tahmin edilmektedir Farklı erime profillerine sahip gen parçalarını tanımlayarak başlayın ve Umelt HETS web tabanlı aracı kullanarak tahmini erime eğrileri oluşturun. Her hedef gen için 300 ila 324 baz çifti gen parçasından oluşan üç çift tasarlayın. Daha fazla analiz için heliksite eksenindeki erime bölgeleri arasındaki maksimum farkı gösteren düzenlenmemiş veya düzenlenmiş çifti seçin.
Mikro-TGGE analizi için, seçilen gen parçasını PCR amplifikasyonu ile sentezleyin. DNA dinamo yazılımını kullanarak ileri ve geri primerleri tasarlayın ve NCBI Primer-BLAST aracını kullanarak astar dizisini doğrulayın. Standart yöntemler kullanarak düzenlenmiş ve düzenlenmemiş genlerin kaynağından toplam RNA'yı çıkarın.
İlgili cDNA'yı sentezleyin, PCR reaksiyon karışımının 20 mikrolitresini hazırlayın ve PCR'yi metin yazısında açıklandığı gibi ayarlayın. Daha sonra, PCR ürününün altı mikrolitresini 250 mikrolitrelik bir tüpte üç mikrolitre 6x jel yükleme boyası ile karıştırın ve toplam hacmi steril suyla 12 mikrolitreye kadar tamamlayın. PCR ürününü daha fazla kullanana kadar 25 santigrat derecede saklayın.
Jel kasetleri monte etmek için, jel polimerizasyonu için jel kaset tutucusundaki diğer iki plaka arasındaki üst jel plakasını sandviç yapın. Poli akrilamid jeli hazırlamak için, 50 mililitrelik bir tüpe 7.2 gram üre ekleyin ve 10 mililitre steril suda çözün. Numuneyi bir mikrodalgada 20 ila 30 saniye ısıtın.
Ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Çözeltiye üç mililitre 5x TBE tampon, 2.25 mililitre akrilamid bis, 75 mikrolitre 10x amonyum persülfat ve 15 mikrolitre TEMED ekleyin. Hava kabarcıklarını önlemek için jel çözeltisini jel kaset tutucuya yavaşça eğimli bir açıyla dökün.
Yaklaşık 30 dakika sonra, jel kasetleri sökün ve temizleyin. Mikro-TGGE aparatını, DNA migrasyon yönüne dik bir sıcaklık gradyanı ile kullanın. Üst ve alt elektroforez tampon pedlerini iki mililitre 1x TBE tamponuna batırın.
Jel kaseti yatay elektroforez haznesi ünitesine yerleştirin ve üst ve alt tampon pedlerini yerleştirin. Daha sonra PCR ürününün 10 mikrolitresini orta kuyucuğa ve PCR ürününün bir mikrolitresini her iki tarafa da yerleştirin. Bir dakika bekleyin, güç ünitesini bağlayın ve 15 ila 65 santigrat derece doğrusal bir sıcaklık gradyanında 12 dakika boyunca 100 volt besleyin.
Çalıştırma tamamlandıktan sonra. kaseti çıkarın ve üst cam kapağı çıkarın. Jel üzerine 300 mikrolitre 10x SYBR Gold lekesi dökün.
Avuç içi boyutundaki elektroforetik cihaza takılı mavi LED el fenerini kullanarak eriyen profilleri görselleştirin. Verilerin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için her elektroforetik deneyi üç kez tekrarlayın. Mikro-TGGE analizör yazılımını indirin ve açın.
Jel görüntüsünü içeren JPEG dosyasını açın. Çerçeve" düğmesine tıklayın ve jel görüntüsünün uygun karesini seçin. Koordinat düzeltme" düğmesine tıklayın ve iki referans noktası ekleyin.
Özellik noktalarının eklenmesi" düğmesine tıklayın ve örnek noktalar ekleyin. Ardından, işlenen jel görüntü verilerini mikro-TGGE formatında kaydedin. Örnek düğmeye tıklayın ve iki veya daha fazla görüntüyü karşılaştırmak için "basit noktaları ara" seçeneğini seçin.
C-to-U RNA düzenleme tipi için, orijinal cBase'e sahip düzenlenmemiş numune, iplik ucu erime noktasında, modifiye edilmiş U tabanına sahip düzenlenmiş numuneden daha uzun bir erime paterni gösterdi. A-to-I RNA düzenleme tipi için, modifiye G tabanına sahip düzenlenmiş numune, iplik ucu erime noktasında, orijinal A tabanına sahip düzenlenmemiş numuneden daha uzun bir erime paterni gösterdi. Ters U-to-C RNA düzenleme tipi için, modifiye C tabanına sahip ilk gendeki düzenlenmiş numune, ipliğin ilk ve son erime noktaları arasında, orijinal U tabanına sahip düzenlenmemiş numuneden daha uzun bir erime paterni gösterdi.
Bununla birlikte, diğer gen için benzer bir model gözlenmemiştir. C-to-you ve A-to-I RNA düzenleme tiplerinin desen benzerlik puanları, iki U-to-C RNA düzenleme tipininkinden daha düşüktü. Bu fark muhtemelen düzenleme sitelerinin ilgili konumlarıyla ilgiliydi.
uMelt HETS analizi, C-to-U modifikasyonunun erime eğrisini sıcaklık ekseni boyunca sola kaydıracağını gösterdi. Düzenlenmemiş ve üç düzenlenmiş parçanın mikro-TGGE analizlerinden hesaplanan örüntü benzerlik puanları, uMelt kullanılarak tahmin edilen sonuçlarla tutarlıydı. Hedef gen parçasının optimizasyonu, düzenlenmiş ve düzenlenmemiş sebep arasındaki net ayrım için kritik öneme sahiptir.
Ve bu işlem mevcut protokolde basitleştirildi.
