この技術は、生きたショウジョウバエ組織における特定の細胞におけるグルコース取り込み量を測定することができるので重要である。FRETベースのセンサーは細胞内のブドウ糖のレベルの変化の直接の測定を提供する。この技術により、研究者はALSモデルとコントロールの生きている運動ニューロン内で、グルコースレベルの変化をリアルタイムで評価することができます。
難しい側面は、バッファを変更した後に同じニューロンのセットをイメージングすることです。サンプルを顕微鏡に残しておくと、VMCの動きができるだけ少なくなっています。分解を開始する前に、イメージング顕微鏡とレーザーをオンにします。
その後、さまよう第三のインスター幼虫を収集し、二重蒸留水でそれを洗い流し、以前に準備されたエラストマー裏地付き皿のHL3バッファーのドロップに置きます。次に、解剖顕微鏡の下で、昆虫ピンで幼虫を慎重に長さに伸ばして、幼虫の前端と後端を幼虫側に固定するために一対の鉗子を使用します。斜めのアイリスはさみを使用して、後部ピンのすぐ上に切開を行います。
次に、幼虫の前端に向かって切開部から垂直に切り取ります。必要に応じてHL3バッファーの数滴を追加した後、中枢神経系を乱すことなく、気管と浮遊器官の残りの部分を除去します。次に、フラップを固定し、神経筋系をそのまま維持しながら体壁を伸ばして中枢神経系を露出させます。
画像取得には、40倍の水浸漬レンズを備えたアップリライト共焦点顕微鏡を使用してください。その後、405ナノメートルレーザーを選択してCFPを励起します。次に、スキャン速度、平均値、目的、ズーム ピンホール サイズ、空間解像度などの取得パラメータを最適化します。
信号が最適なダイナミックレンジになるようにゲインを調整し、すべての遺伝子型に同じパラメータを使用します。腹側神経コード内の運動ニューロンを画像化するには、解剖標本を含むシリコーン皿をレンズの下に置き、トレハロースクロースHL3バッファーに接触するようにレンズを下げます。レンズがバッファーに完全に沈み込み、必要に応じてバッファーを追加することを確認します。次に。
CFPおよびFRETチャネルを使用して、腹側神経コードの正線に沿って位置する焦点の少なくとも6つの運動ニューロンからなる光学選択を手動で選択する。その後、10秒ごとに10分間画像を取得します。これらのイメージはベースラインを表します。
グルコース刺激のために、パスツールピペットを使用してHL3バッファーを含むトレハロースクローススクロースを除去し、腹側神経コードを動かすことなく5ミリモルグルコース補充HL3バッファーを追加します。その後、さらに10分間、10秒ごとに画像を取得します。これらの画像は、刺激フェーズを表します。
CZIファイルまたは画像ソフトウェアでサポートされている任意のファイルの種類として、日付、遺伝的背景、実験条件や使用チャンネルなどのファイル名を保存します。パラメーターを再利用して、すべての遺伝子型をイメージ化します。画像処理の場合、フィジー-ImageJイメージングソフトウェアを開き、CZIファイルを開き、ハイパースタックを使用してビュースタックを選択し、カラーモードをグレースケールに設定し、分割チャンネルを別々のウィンドウに選択します。次に。
ドリフト補正プラグイン、ターボregとスタックregを使用して画像を処理します。各チャネルは、プラグインの下でスタック reg を選択し、変換から変換を選択することで個別に修正されます。時系列全体にわたってフォーカスが残っているすべての運動ニューロンをトレースして、対象領域または ROI を手動で選択します。
次に ROI マネージャを使用して、各運動ニューロンのアウトラインを保存します。マルチメジャー関数を使用して、各時点の各 ROI の平均グレー値を測定します。次に、最初のチャンネルから、刺激前イメージの 2 番目のチャンネルにトレースされた ROI をコピーします。
データ分析では、FRET チャネルと CFP チャネルの平均グレー値を使用して、CFP 比で FRET を計算します。CFP比によるFRETの変化は、細胞内グルコース濃度の変化を反映している。次に、ROI とタイム ポイント対時間ごとの CFP 比で FRET をプロットします。
遺伝的にコード化されたFRETベースのグルコースセンサーを使用して、運動ニューロンのグルコース取り込み量を測定しました。グルコースがセンサーに結合していない場合、CFP励起はCFPの排出のみを引き起こす。そして、グルコースが結合すると、CFPとYFPの間で発生するFRETによりYFP信号を検出することができます。
ベースラインおよび刺激条件下でのTDP-43変異ニューロンにおけるグルコースセンサ制御におけるFRETおよびCFP信号の画像を以下に示す。ROIの例として、各画像に代表的な運動ニューロンが概説されています。グルコース刺激の際、グルコースセンサを発現する制御運動ニューロンは、TDP-43を発現するニューロンが有意に高いグルコース取り込み量を示している間、グルコース取り込みのわずかな増加を示す。
さらにTDP-43変異運動ニューロンのCFP比によるFRETは、各時点でグルコースセンサ制御に正規化した。ベースライン条件下では、遺伝子型間に差はなかった。しかし、グルコース刺激の際、TDP-43変異体においてグルコース取り込みの急激かつ有意な増加が対照と比較して観察された。
棒グラフ表現では、グルコースセンサーを発現するニューロンにおけるグルコース刺激は、ベースラインと比較してCFP比によるFRETの小さいながらも有意な増加を示した。対照的に、TDP-43を発現するニューロンは、ベースラインと比較して刺激時の比率が有意に増加した。TDP-43とグルコースセンサーを発現する運動ニューロン間のCFP比によるFRETの正味差は、イメージングの過程でニューロンが死なないように、この手順では約10.9%の時間管理が重要です。
これを避けるためには、切り分けの直後に画像を作成することが重要です。この技術は、ニューロンにおけるグルコース代謝の重要性を強調し、運動ニューロン再生における解糖の役割をさらに調査するグループを導いた。
