טכניקה זו היא משמעותית כי זה יכול למדוד ספיגת גלוקוז בתאים ספציפיים ברקמות Drosophila חי. החיישן מבוסס FRET מספק מידה ישירה של שינויים ברמות הגלוקוז התאיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להעריך שינויים ברמות הגלוקוז בזמן אמת, בתוך נוירונים מוטוריים חיים ממודלים של ALS לעומת פקדים.
היבט מאתגר הוא הדמיית אותו סט של נוירונים לאחר שינוי המאגר. השארת המדגם על המיקרוסקופ מסייעת להבטיח כי VMC נע מעט ככל האפשר. לפני תחילת הניתוחים להפעיל את מיקרוסקופ הדמיה ולייזרים.
לאחר מכן לאסוף זחל instar שלישי נודד, לשטוף אותו עם מים מזוקקים כפולים ומניחים אותו טיפה של חוצץ HL3 על צלחת מרופד אלסטומר שהוכן בעבר. לאחר מכן תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש בזוג מלקחיים כדי להצמיד את הקצוות הקדמיים והאחוריים של הזחל, צד גבי למעלה, על ידי מתיחת הזחל בזהירות אורך חכם עם סיכות חרקים. באמצעות זוג מספריים זוויתיים של איריס, לעשות תקע ממש מעל הסיכה האחורית.
ואז לעשות חתך אנכי מן החתך לכיוון הקצה החלקה הסופית של הזחל. לאחר הוספת כמה טיפות של חוצץ HL3 במידת הצורך, להסיר את קנה הנשימה ואת שאר האיברים הצפים מבלי להפריע למערכת העצבים המרכזית. לאחר מכן להצמיד את המדפים, מותח את דופן הגוף כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית תוך שמירה על המערכת neuromuscular שלם.
לרכישת תמונה, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל זקוף עם עדשת טבילת מים פי 40. לאחר מכן בחר את לייזר 405 ננומטר כדי לרגש את CFP. לאחר מכן, מטב את פרמטרי הרכישה כגון מהירות סריקה, ממוצע, מטרה, גודל חור זום ורזולוציה מרחבית.
התאם את הרווח כך שהאות נמצא בטווח הדינמי האופטימלי והשתמש באותם פרמטרים עבור כל הגנוטיפים. כדי לדמיין נוירונים מוטוריים בתוך כבל העצבים הגחון, מניחים את צלחת הסיליקון עם המדגם המנותח מתחת לעדשה ומנמיכים את העדשה כך שהיא באה במגע עם חיץ סוכרוז HL3. ודא שהעדשה שקועה לחלוטין במאגר והוסף מאגר נוסף במידת הצורך. הבא.
באמצעות ערוצי CFP ו- FRET, בחר באופן ידני מבחר אופטי המורכב משישה נוירונים מוטוריים לפחות בפוקוס הממוקמים לאורך קו האמצע של כבל העצב הגחון. לאחר מכן לרכוש תמונות כל 10 שניות במשך 10 דקות. תמונות אלה מייצגות את קו הבסיס.
לגירוי גלוקוז, הסירו את סוכרוז הטרהלוז המכיל חיץ HL3 באמצעות פיפטה פסטר והוסיפו חמישה מילימול גלוקוז בתוספת חיץ HL3 מבלי להזיז את חוט העצבים הגחון. לאחר מכן לרכוש תמונות כל 10 שניות במשך 10 דקות נוספות. תמונות אלה מייצגות את שלב הגירוי.
שמור את התמונות כקבצי CZI או כל סוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ההדמיה עם שם קובץ הכולל תאריך, רקע גנטי, מצב ניסיוני וערוצים בהם נעשה שימוש. שימוש חוזר בפרמטרים כדי לדמות את כל הגנוטיפים. לעיבוד תמונה פתחו את תוכנת ההדמיה Fiji-ImageJ ולאחר מכן פתחו את קבצי CZI, בחרו 'תצוגת מחסנית' עם הערימה והגדירו מצב צבע לקנה מידה אפור ובחרו ערוצים מפוצלים לחלונות נפרדים. הבא.
לעבד את התמונות באמצעות תוספים תיקון נסחף, reg טורבו ו reg מחסנית. כל ערוץ מתוקן בנפרד על-ידי בחירת reg מחסנית תחת תוספים ולאחר מכן בחירת טרנספורמציה לתרגום. בחר באופן ידני את אזורי העניין או ההון על-ידי מעקב אחר כל הנוירונים המוטוריים שנותרו בפוקוס לאורך כל סדרת הזמן.
לאחר מכן השתמש במנהל ה- ROI כדי לשמור כל קו מתאר של נוירון מוטורי. השתמש בפונקציית ריבוי המידה כדי למדוד את הערך האפור הממוצע בכל עלה על תנאי בכל נקודת זמן. לאחר מכן העתק את ההעלות על תנאי שאותרו מהערוץ הראשון לערוץ השני עבור תמונת קדם הגירוי.
עבור ניתוח נתונים, חשב את יחס FRET על-ידי CFP באמצעות הערכים האפורים הממוצעים עבור ערוצי FRET ו- CFP. שינויים ביחסי FRET על ידי CFP משקפים שינויים בריכוז הגלוקוז התאי. לאחר מכן התווה FRET לפי יחסי CFP עבור כל נקודת ROI ונקודת זמן לעומת זמן.
חיישן גלוקוז מבוסס FRET מקודד גנטית שימש למדידת ספיגת גלוקוז בתאי עצב מוטוריים. כאשר גלוקוז אינו מאוגד לחיישן, עירור CFP גורם לפליטת CFP בלבד. וכאשר גלוקוז נקשר, האות YFP ניתן לזהות עקב FRET המתרחשת בין CFP ו YFP.
מוצגות כאן תמונות של אותות FRET ו- CFP בבקרות חיישן גלוקוז בתאי עצב מוטנטיים TDP-43 בתנאי בסיס וגירוי. נוירון מוטורי מייצג מתואר בכל תמונה כדוגמה של ROI. עם גירוי גלוקוז, נוירונים מוטוריים שליטה המביעים חיישני גלוקוז, להפגין עלייה קטנה בספיגת גלוקוז בעוד נוירונים המבטאים TDP-43 הראו ספיגת גלוקוז גבוהה משמעותית.
FRET נוסף על ידי יחסי CFP של נוירונים מוטוריים מוטנטיים TDP-43 היו מנורמלים לבקרות חיישן גלוקוז בכל נקודת זמן. בתנאים בסיסיים, לא היה הבדל בין הגנוטיפים. עם זאת, עם גירוי גלוקוז, עלייה מהירה ומשמעותית בספיגת הגלוקוז נצפתה במוטנטים TDP-43 בהשוואה לשליטה.
בייצוג גרף עמודות, גירוי גלוקוז בנוירונים המבטאים את חיישן הגלוקוז הדגים עלייה קטנה אך משמעותית ב- FRET על ידי יחס CFP בהשוואה לקו הבסיס. לעומת זאת, נוירונים המבטאים TDP-43 הראו עלייה משמעותית ביחס עם גירוי בהשוואה לקו הבסיס. ההבדל נטו FRET על ידי יחסי CFP בין נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43 וחיישן גלוקוז הוא סביב 10.9% ניהול זמן הוא קריטי עבור הליך זה, כך הנוירונים לא למות במהלך ההדמיה.
חשוב לדמות מיד לאחר ניתוחים כדי להימנע מכך. טכניקה זו הדגישה את החשיבות של חילוף החומרים של גלוקוז בתאי עצב והובילה את הקבוצה שלנו לחקור עוד יותר את תפקיד הגליקוליזה בהתחדשות נוירונים מוטוריים.
