Diese Technik ist von Bedeutung, da sie die Glukoseaufnahme in bestimmten Zellen in lebenden Drosophila-Geweben messen kann. Der FRET-basierte Sensor liefert ein direktes Maß für Veränderungen des intrazellulären Glukosespiegels. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Veränderungen des Glukosespiegels in Echtzeit in lebenden Motoneuronen aus ALS-Modellen im Vergleich zu Kontrollen zu bewerten.
Ein herausfordernder Aspekt ist die Abbildung des gleichen Satzes von Neuronen nach dem Ändern des Puffers. Wenn Sie die Probe auf dem Mikroskop belassen, wird sichergestellt, dass sich der VMC so wenig wie möglich bewegt. Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das bildgebende Mikroskop und die Laser ein.
Sammeln Sie dann eine wandernde Larve im dritten Stadium, spülen Sie sie mit doppelt destilliertem Wasser ab und legen Sie sie in einen Tropfen HL3-Puffer auf eine zuvor vorbereitete, mit Elastomer ausgekleidete Schale. Als nächstes verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Pinzette, um das vordere und hintere Ende der Larve mit der dorsalen Seite nach oben zu fixieren, indem Sie die Larve vorsichtig der Länge nach mit Insektenstiften dehnen. Machen Sie mit einer abgewinkelten Iris-Schere einen Schnitt direkt über dem hinteren Stift.
Dann machen Sie einen vertikalen Schnitt von der Inzision in Richtung des vorderen Endes der Larve. Nachdem Sie bei Bedarf ein paar Tropfen HL3-Puffer hinzugefügt haben, entfernen Sie die Luftröhre und den Rest der schwimmenden Organe, ohne das zentrale Nervensystem zu stören. Dann stecken Sie die Klappen fest und dehnen Sie die Körperwand, um das zentrale Nervensystem freizulegen, während das neuromuskuläre System intakt bleibt.
Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse. Wählen Sie dann den 405-Nanometer-Laser aus, um das CFK anzuregen. Optimieren Sie als Nächstes die Erfassungsparameter wie Scangeschwindigkeit, Durchschnitt, Objektiv, Zoom-Lochgröße und räumliche Auflösung.
Passen Sie die Verstärkung so an, dass das Signal im optimalen Dynamikbereich liegt, und verwenden Sie die gleichen Parameter für alle Genotypen. Um Motoneuronen innerhalb des ventralen Nervenstrangs abzubilden, legen Sie die Silikonschale mit der sezierten Probe unter die Linse und senken Sie die Linse ab, so dass sie mit dem Trehalose-Saccharose-HL3-Puffer in Kontakt kommt. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv vollständig in den Puffer eingetaucht ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Puffer hinzu. Nächster.
Wählen Sie mithilfe der CFP- und FRET-Kanäle manuell eine optische Auswahl aus, die aus mindestens sechs fokussierten Motoneuronen besteht, die sich entlang der Mittellinie des ventralen Nervenstrangs befinden. Nehmen Sie dann alle 10 Sekunden Bilder für 10 Minuten auf. Diese Bilder stellen die Grundlinie dar.
Zur Glukosestimulation entfernen Sie die Trehalose-Saccharose, die HL3-Puffer enthält, mit einer Pasteur-Pipette und fügen Sie fünf millimolaren Glukose-ergänzten HL3-Puffer hinzu, ohne den ventralen Nervenstrang zu bewegen. Nehmen Sie dann alle 10 Sekunden Bilder für weitere 10 Minuten auf. Diese Bilder stellen die Stimulationsphase dar.
Speichern Sie die Bilder als CZI-Dateien oder einen anderen von der Imaging-Software unterstützten Dateityp mit einem Dateinamen einschließlich Datum, genetischem Hintergrund, experimentellem Zustand und verwendeten Kanälen. Verwenden Sie die Parameter wieder, um alle Genotypen abzubilden. Öffnen Sie für die Bildverarbeitung die Imaging-Software Fiji-ImageJ, öffnen Sie dann die CZI-Dateien, wählen Sie View Stack mit Hyper-Stack und stellen Sie den Farbmodus auf Graustufen ein und wählen Sie split channels in separate Fenster. Nächster.
Verarbeiten Sie die Bilder mitHilfe von Driftkorrektur-Plug-Ins, Turbo Reg und Stack Reg. Jeder Kanal wird separat korrigiert, indem Sie unter Plug-Ins Stack Reg auswählen und dann Transformation in Translation auswählen. Wählen Sie manuell die interessierenden Regionen oder ROIs aus, indem Sie alle Motoneuronen verfolgen, die über die gesamte Zeitreihe im Fokus bleiben.
Verwenden Sie dann den ROI-Manager, um jede Motoneuron-Gliederung zu speichern. Verwenden Sie die Multi-Measure-Funktion, um den grauen Mittelwert in jedem ROI zu jedem Zeitpunkt zu messen. Kopieren Sie dann die ROIs, die vom ersten Kanal in den zweiten Kanal für das Pre-Stimulation-Bild verfolgt wurden.
Berechnen Sie für die Datenanalyse das Verhältnis FRET nach CFP anhand der grauen Mittelwerte für die FRET- und CFP-Kanäle. Änderungen der FRET-by-CFP-Verhältnisse spiegeln Veränderungen der intrazellulären Glukosekonzentration wider. Zeichnen Sie dann FRET nach CFP-Verhältnissen für jeden ROI und Zeitpunkt im Vergleich zur Zeit auf.
Ein genetisch kodierter FRET-basierter Glukosesensor wurde verwendet, um die Glukoseaufnahme in Motoneuronen zu messen. Wenn Glukose nicht an den Sensor gebunden ist, verursacht die CFP-Anregung nur eine CFP-Emission. Und wenn Glukose bindet, kann das YFP-Signal aufgrund von FRET zwischen CFP und YFP erkannt werden.
Hier sind Bilder von FRET- und CFP-Signalen in Glukosesensorsteuerungen in TDP-43-mutierten Neuronen unter Baseline- und Stimulationsbedingungen gezeigt. Ein repräsentatives Motoneuron wird in jedem Bild als Beispiel für den ROI dargestellt. Bei Glukosestimulation zeigen Kontrollmotorneuronen, die Glukosesensoren exprimieren, einen kleinen Anstieg der Glukoseaufnahme, während Neuronen, die TDP-43 exprimieren, eine signifikant höhere Glukoseaufnahme zeigten.
Weitere FRET by CFP-Verhältnisse von TDP-43-mutierten Motoneuronen wurden zu jedem Zeitpunkt auf Glukosesensorkontrollen normalisiert. Unter Ausgangsbedingungen gab es keinen Unterschied zwischen den Genotypen. Bei Glukosestimulation wurde jedoch ein schneller und signifikanter Anstieg der Glukoseaufnahme bei TDP-43-Mutanten im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.
In einer Balkendiagrammdarstellung zeigte die Glukosestimulation in Neuronen, die den Glukosesensor exprimieren, einen kleinen, aber signifikanten Anstieg des FRET-by-CFP-Verhältnisses im Vergleich zur Baseline. Im Gegensatz dazu zeigten Neuronen, die TDP-43 exprimierten, einen signifikanten Anstieg des Verhältnisses bei Stimulation im Vergleich zum Ausgangswert. Der Nettounterschied in den FRET-by-CFP-Verhältnissen zwischen Motoneuronen, die TDP-43 exprimieren, und Glukosesensor beträgt etwa 10,9%Das Zeitmanagement ist für dieses Verfahren entscheidend, damit die Neuronen im Laufe der Bildgebung nicht absterben.
Es ist wichtig, sich unmittelbar nach den Sezierungen ein Bild zu machen, um dies zu vermeiden. Diese Technik hat die Bedeutung des Glukosestoffwechsels in Neuronen hervorgehoben und unsere Gruppe dazu veranlasst, die Rolle der Glykolyse bei der Regeneration von Motoneuronen weiter zu untersuchen.
