ROMA, ikiden az hastalığa neden olan CFTR mutasyonu bulunduğunda ve ter florürü orta derecede olduğunda, kistik fibrozisli ve kistik fibrozsuz deneklerden organoidler arasında ayrım yapabilir. ROMA her yaşta ve düşük komplikasyon oranları ile yapılabilir. Analiz yarı otomatik ve standartlaştırılmıştır ve biyopsiler analiz için merkezi bir laboratuvara gönderilebilir.
ROMA için kullanılan organoidler CFTR modülatör etkinliğine erişmek için de kullanılabilir ve ROMA CFTR fonksiyonunun restorasyon derecesini ölçmeye yardımcı olabilir. Kaplamadan bir gün sonra, organoidleri kalsiyum yeşili ile lekeleyin. Kalsiyum yeşilinin tüm kuyucukta homojen dağılımını sağlamak için plakayı kapakla birkaç kez döndürün ve hafifçe eğin.
Kuyucuklardaki tüm organoidlerin lekelenmesini sağlamak için plakayı 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika ve% 5 karbondioksitte tekrar inkübe edin. Organoidlere odaklanmak için, optimal X ve Y pozisyonunu belirleyin ve konfokal mikroskobu kullanarak her bir kuyucuktaki organoidlere manuel olarak odaklanın. Ve bu pozisyonları görüntüleme yazılımına kaydedin.
Daha sonra, canlı hücre görüntüleme ayarlarını kullanarak, emisyonu 488 nanometreye ve uyarımı 515 nanometreye ve LD büyütme hedefini 5X'e ayarlayın. Organoid resimler elde etmek için, 1024 piksel x 1024 piksel çözünürlükte ve konfokal mikroskopla 16 bit derinlikte birim yönlü bir şekilde görüntüler çekin. Kistik fibroz ve kistik fibroz dışı organoidler arasındaki morfolojik farklılıkların optimal olarak görselleştirilmesi için lazer yoğunluğunu ve master kazancını seçin.
Görüntüleri yakalamak için denemeyi başlatın. Daha sonra, mikroskop formatında 32 kuyucuğun tümü için kuyucuk başına bir resim kaydedin ve bunları TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. İlk olarak, TIFF dosyalarını görüntü analiz yazılımına yükleyin ve ardından operatör tarafından belirlenen dışlama kriterlerine göre ilk kalite kontrolünü gerçekleştirin.
Kaplama yoğunluğu yetersiz olduğunda, çok fazla veya çok az organoid bulunduğunda ve yetersiz floresan dağılımı olduğunda birçok farklılaşmış veya ölü yapı veya enkaz varsa, resim kümesini hariç tutun. Görüntüleri analize hazırlamak için, her organoid kültür için 32 resmin tümünden oluşan bir ağ veri dosyası oluşturun ve açın, böylece konu başına 32 resmin tümünün eşzamanlı analizini sağlayın. Ve görüntüleri yeniden kalibre edin, böylece bir piksel 2,5 x 2,5 mikrometreye karşılık gelir.
Ardından, 4.500'lük bir düşük yoğunluk eşiği ve 65.535'lik bir üst eşik kullanarak, düzgün ve temiz işlevleri kapatarak, doldurma delikleri işlevini açarak ve ayrı işlevi 3X'e koyarak yapıları tanımlayın. Organoidleri saymak için, 40 mikrometreden daha büyük veya buna eşit tüm yapıları seçin. Ardından, ND ölçümünü güncelle düğmesine tıklayın ve sayılan organoidler numaralandırılacaktır.
Hesaplama için yoğunluğu ve daireselliği ölçmek için, 60 mikrometreden büyük veya buna eşit tüm yapıları seçin ve sayın. Ardından, resmin kenarlıklarına dokunan tüm yapıları kaldırın. Ardından, her birinin sınırından bir pikseli, 60 mikrometre yapıdan daha fazla veya buna eşit olarak aşındırın ve her yapının ortalama yoğunluğunu ölçün.
Daha sonra, 60 mikrometreden fazla veya ona eşit tüm yapıları tekrar seçin ve her birinin sınırından 10 piksel, 60 mikrometre yapıdan daha fazla veya buna eşit aşındırın. Ardından, aşınmış her yapının ortalama yoğunluğunu ve her yapının daireselliğini ölçün. Daha sonra, her birinin sınırından 25 mikrometreyi aşındırdıktan sonra, her birinin sınırından 2,5 mikrometreyi aşındırdıktan sonra, 60 mikrometre yapısına eşit veya 60 mikrometre yapısına eşit olan yoğunluk ölçümünün ortalamasıyla, yoğunluk ölçümünü bölerek yoğunluk oranını hesaplayın.
Makalede açıklandığı gibi yazılım tarafından belirlenen dışlama kriterlerine dayanarak ikinci kalite kontrolünü gerçekleştirin. 212 denekten organoidler toplandı ve görüntülendi. Kistik fibrozis ve CFTR mutasyonlarına neden olan iki hastalığı olan 167 olgudan 23 set resim çıkarıldıktan sonra ve 22 kistik fibrozis dışı denekten organoid resimler analiz edildikten sonra, kültür başına ortalama organoid sayısı 1.519 olarak bulunmuştur.
Kistik fibrozisli ve kistik fibrozissiz deneklerden organoidler için yoğunluk oranı ve dairesellik indeksi belirlendi. Bu iki indeks kullanılarak, sadece 32 kuyunun tümünden elde edilen veriler kullanıldığında değil, aynı zamanda her kültür için rastgele sekiz kuyu seçildiğinde, kistik fibrozisli ve kistik fibrozissiz deneklerden organoidler arasında mükemmel bir ayrım elde edildi. Döngüsellik için değerlerin dağılımını, organoidin orta kısmının yoğunluğunu ve tüm organoidin yoğunluğunu gösteren dört açıklayıcı kültür için histogramlar elde edildi.
Yoğunluk oranının ve döngüsellik endeksinin doğru hesaplanması için yüksek kaliteli resimler gerektiğinden, kalite kontrolü esastır. ROMA için kurulan organoid kültürler, CFTR tedavisinin etkisini test etmek için fizik yardımları için de kullanılabilir. RNA, DNA ve protein, CFTR varyantlarının daha ileri karakterizasyonu için ekstrakte edilebilir.
