Koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları saymak, mikrobiyolojide standart bir tekniktir, ancak yavaştır ve çok sayıda agar plakası gerektirir. Tekniğimiz, her iki zaman agar plakasında geleneksel CFU sayma yöntemlerine göre yüz kat avantaj sağlar. Küçük hayvan modellerinin, özellikle meyve sineklerinin bağırsak mikrobiyomunu ölçmek için metodolojiyi uyguladık.
Bu protokol, gnotobiyotik sineklerdeki CFU'ları ölçmenin basit, hızlı ve otomatik bir yoludur. Bu protokol, CFU'ların fotoğrafını çekmek için DIY tarafından üretilen enstrümantasyon ve bunları saymayı otomatikleştirmek için özel yazılım içeren bir iş akışı sağlar. Bu protokol, daha verimli kaplama ve CFU sayma yöntemlerinin yararlı olabileceği herhangi bir mikrobiyoloji deneyinde kullanılabilir.
Sinekleri verimli bir şekilde kullanmak ve plakaları tespit etmek manuel el becerisi gerektirir, bu nedenle bu uygulanmalıdır. Otomatik sayım yazılımını kullanmak, eşik hakkında karar vermeyi gerektirir, bu nedenle makbuzlar, deneyiniz için en iyi parametreleri belirlemek için manuel sayımlarla karşılaştırılmalıdır Prosedürü göstermek, tekniği geliştiren laboratuvarımdan bir araştırmacı olan Ren Dodge olacaktır. Başlamak için, boncuk ölçüm tepsisine 0,5 mikron cam boncuk dökün.
Boncukları tepsiye yayın, böylece tüm kuyucuklar dolu ve düzleşir. Ardından, fazla boncukları konik bir tüpe fırçalayın. Şimdi, yarı etekli bir PCR plakasını ölçüm tepsisine baş aşağı yerleştirin ve ölçüm tepsisindeki girintiye yerleştirerek kuyucuklarla hizalayın.
Ardından, boncukları aktarmak için hızlıca ters çevirin. PCR plaka yüzeyinden fazla boncukları çıkarın. Tüm kuyuların boncuk içerdiğinden emin olun.
Gerekirse, tek bir kuyucuğa boncuk eklemek için bir tartım kepçesi kullanın. Ardından, plakayı alüminyum folyo ve otoklav ile örtün. Plakayı kullanmadan önce, 96 kanallı pipetleyiciyi kullanarak sinekleri eklemeden hemen önce her bir kuyucuğa 100 mikrolitre PBS ekleyin.
Anestezi altındaki sinekleri yüzey sterilize etmek için, sinekleri şişeden küçük bir huni kullanarak 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hemen tüpe bir mililitre% 70 etanol püskürtün, tüpü kapatın ve 10 saniye boyunca ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, herhangi bir sineği aspire etmekten kaçınırken etanolün bir P-1000 pipeti ile aspire edilmesini sağlayın.
Son PBS yıkamasından sonra, tüpü kapatın ve sineklerin kapağa girmesi için kapak tarafı aşağı bakacak şekilde tezgaha birkaç kez sert bir şekilde dokunun. Tüpü açtıktan sonra, forseps kullanarak sinekleri kuyucuklara dağıtın ve her kuyucuğa bir sinek yerleştirin. Yükleme sırasında plakayı buz üzerinde tutarak sinekleri anestezi altında tutun.
Kuyucuklara yakın başıboş boncukları çıkarın, çünkü bunlar folyo contasını kırabilir ve sızıntıya neden olabilir. Sızdırmazlık folyonun donuk tarafının plaka üzerinde aşağı doğru yönlendirildiğinden ve parlak tarafın ısı sızdırmazlık elemanına doğru baktığından emin olun. Isı sızdırmazlık maddesini beş saniye boyunca sıkıca bastırın ve folyoyu sabitlemek için el aplikatörü ile yakın.
Sinekleri beş dakika boyunca homojenize edin. Sineklerin tamamen homojenize edildiğinden ve çözeltinin renklendiğinden emin olun. Sızdırmazlık folyosundan sıvıyı çıkarmak için, boncuk plakasını 350 G'de mini bir plaka eğirici içinde 30 saniye boyunca döndürün.Sinek homojenatı damlacıklarının sıçramasını önlemek için plakayı tutarken folyoyu çıkarın.
Üç dikdörtgen MRS agar büyüme plakasını, kapakları açık olarak biyogüvenlik kabinine en az 10 dakika kuruması için yerleştirin. 96 kanallı bir pipetleyici kullanarak steril 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre PBS ekleyerek iki seyreltme plakası hazırlayın. 96 kanallı pipetleyiciye P-20 uçlarından oluşan bir raf yerleştirin.
Numune plakasından 11,1 mikrolitre homojenat aspire ederek 1:10 seyreltme yapın. Şimdi, kuyucuk başına 100 mikrolitre steril PBS içeren ilk seyreltme plakasına dağıtın. Seyreltme plakasını plaka çalkalayıcıda 600 RPM'de 10 saniye boyunca tutun.
En az 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek tekrar karıştırın. İlk seyreltme plakasından ikinci seyreltme plakasına 11,1 mikrolitre aktarın ve daha fazla seyreltme için karıştırma adımlarını tekrarlayın. Plakaları tespit etmek için, her bir kuyucuktan iki mikrolitreyi 96 kanallı pipetleyiciye yükleyin.
Pipetleyici kafasını yavaşça plakanın üzerine indirin, agarın içine bıçaklanmaktan kaçının ve tüm lekelerin dağıtıldığından emin olun. Ardından, sıvı lekelerin hızla agarın içine batırıldığını ve birlikte çalışmadığını kontrol edin. Kalan seyreltme plakaları için kaplama işlemini makalede açıklandığı gibi tekrarlayın.
Sıvı agar içine tamamen emildikten sonra, plakaları ters çevirin ve koloniler optimal boyuta ulaşana kadar inkübe edin. Plakaları mantıklı bir şekilde düzenleyin ve fotoğraf çekerken belirli bir sırada tutun. Onları yönlendirin, böylece A1 tüm plakalar için sol üst köşede olur.
Plaka kapağını çıkardıktan sonra, plakayı A1 doğru köşeye yönlendirilmiş olarak sahneye yerleştirin. Plakaları görüntüleyin. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve deneme adı, ortam türü, seyreltme faktörü ve diğer ilgili ayrıntılar dahil olmak üzere yeniden adlandırın.
Niceleme için işlenecek görüntüleri bir klasörde düzenleyin. Plakaları ayırt eden dosya adları, çıktı elektronik tablosundaki her sayım kümesi için sütun başlıkları haline gelir. Klasörde Kırpılmış ve Alındılar adlı alt klasörler oluşturun.
Bu klasörler çıktı dosyalarını alır. Şimdi ImageJ'den Croptacular eklentisini başlatın ve kırpmaya başlamak için Tamam'ı tıklayın. Kaynak klasörü seçmek için bir iletişim kutusu açılacaktır.
Tamam'ı tıklatın. Kaynak klasörü seçin ve Aç'ı tıklatın. Ardından, hedef dizini seçmek için iletişim kutusunda Tamam'ı tıklatın. Hedef klasörü seçin ve Aç tuşuna basın.
Görüntü zaten düzse, Boşluk tuşuna basmanız yeterlidir. Aksi takdirde, yatay hale gelmesi gereken bir kenar boyunca bir çizgi çizerek görüntüyü düzeltin. Görüntü düz görünmüyorsa çizgiyi gerektiği kadar yeniden çizin.
Ardından, sayım alanı için bir sınır kutusu çizin ve tüm noktalar hücrelerinin içinde olana kadar boyutunu ve oranını ayarlayın. Kılavuzu yenilemek için imleci sınır kutusunun dışına sürükleyin. Izgara iyi göründüğünde, Boşluk tuşuna basın.
Eklenti tüm fotoğrafların aynı şekilde hizalanacağını varsaydığından, bir sonraki görüntünün otomatik olarak ilki ile aynı açıya döndüğünden emin olun. Bu doğruysa, devam etmek için Boşluk tuşuna basın. Aksi takdirde, görüntüyü daha önce olduğu gibi düzeltin.
Izgara ayrıca önceki görüntüyle aynı konumu da hatırlar. Gerekirse ayarlayın ve Boşluk tuşuna basın. Count-On-It'i başlatın ve Gridiron'u seçin.
Eşik koloni yoğunluğunu bir üst ve bir alt piksel yoğunluğu değerine göre ayarlayın. Tüm kolonileri seçerken eşiği mümkün olduğunca sıkı hale getirin. Eşik tatmin edici olduğunda Gerekli Eylem iletişim kutusunda Tamam'ı tıklayın, ardından devam etmek için Tamam'ı tıklayın.
İlk görüntüde, devam etme veya ayarlar menüsüne geri dönme seçeneği verilmiştir. Toplu işleme devam etmek için Tamam'ı tıklatın. Ardından, makbuzları ve sonuç tablosunu saklamak için bir klasör seçin. Daha önce oluşturulan Alındılar klasörünü kullanın.
İlk görüntüden sonra, aşağıdaki görüntüler varsayılan olarak önceki ayarlarla aynı eşiğe ulaşacaktır. Bu ayarları kullanmak veya ayarları yapmak için Tamam'ı tıklatın. Yazılım tarafından üretilen sayım makbuzlarını gözden geçirin ve sayım hatalarını manuel olarak düzeltin.
ImageJ eklentisi istatistiksel olarak doğrudur, ancak hatalar oluşur. Aykırı değerleri incelemek ve yanlış sayımları belirlemek için makbuzları kanıtlayın. Yazılım, CFU verilerini makbuzlarla aynı klasöre CSV dosyası olarak kaydeder.
Lactobacillus plantarum ile kolonize edilen sinekler için, günlük olarak steril gıdaya aktarılan, günlük olarak transfer edilen, analizden dört saat önce steril yiyeceklerde tutulan veya günlük olarak transfer edilen ve analizden dört saat önce steril agar üzerinde tutulan sinekler için bakterilerde, aşılamadan sonra steril gıdaya asla aktarılmayan sineklere kıyasla önemli bir azalma olmuştur. Benzer sonuçlar, transfer edilen, transfer sonrası ve temizlenen sineklerin CFU'larda önemli bir azalma gösterdiği, ancak yıkamanın ölçülebilir bir etkiye sahip olmadığı, CFU'lardaki azalmanın bakterilerin kütikülden ziyade bağırsaktan temizlenmesinden kaynaklandığını düşündüren Acetobacter endonezya ile beslenen sineklerde de gözlenmiştir. Nokta başına 2 ila 25 koloni bulunan noktalardaki CFU sayısı, geleneksel yönteme kıyasla hiçbir fark göstermedi.
Ortalama 35 koloni olan lekeler, kontrol yayılma plakalarından daha düşük CFU'lar gösterdi. Bu azalma, yoğun noktalarda üst üste binen kolonilerden kaynaklanıyor olabilir. Plaka fotoğraflarında, koloni yoğunluğu arka plandan% 300 daha yüksekti.
Lactobacillus plantarum mCherry-pozitif koloniler, mCherry-negatif kolonilerden% 1.000 daha yüksek kırmızı yoğunluk gösterdi. Acetobacter indonesiensis GFP-pozitif koloniler, GFP-negatif kolonilerden% 200 daha yüksek yeşil yoğunluk gösterdi. ImageJ için Count-On-It eklentisi, plaka fotoğraflarından CFU sayımını otomatikleştirir.
Koloniler, manuel sayımla karşılaştırılabilir sayımlarla doğru bir şekilde tespit edilir. Sayım makbuzları, yanlış sayımları tanımlamak için kullanılabilir. Değişen boyut eşikleri ve floresan dalga boyları, farklı koloni morfolojilerinin ayrı ayrı sayılmasını sağlar.
Boncuk boncuklanmadan önce plakanın iyi kapatıldığından emin olmak önemlidir. Ölçümlerinizi kalibre etmek için pozitif kontroller tasarlamak da önemlidir. Bu tekniği, karışık bakteri topluluklarını incelememize izin veren 96 kuyucuklu plakalardaki in vitro bakteri popülasyonlarını incelemek için de kullanıyoruz.
Bu teknik, bağırsak kolonizasyonunu ve kolonizasyondaki biyolojik varyasyonu ölçmek için yüksek verimli tarama yaklaşımlarına izin verir.
