İmmünofloresan boyama ve görüntüler için Gi Bum Kim'e teşekkür ederiz. Ayrıca protokolle ilgili yararlı tavsiyeleri için Emily Hatanaka, Naomi Kobritz ve Paul Linesch'e teşekkür ederiz.

Bu protokoldeki tüm prosedürler Cedars Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Homozigot mTmG fareleri, aşağıdaki protokolde kullanılmak üzere karışık cinsiyetli, heterozigot mTmG farelerinin yavrularını elde etmek için C57BL / 6J farelerle yetiştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları doğum sonrası 0. ve 3. günler arasında elektroporasyona tabi tutuldu (P0-P3).
1. Cerrahi kurulum
<ol><li>Ameliyat masasına kimyasal dezenfektan (örneğin Vimoba) püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ekleyin ve tekrar silin.</li>
	<li>Aşağıdaki aletleri/malzemeleri ameliyat masasına yerleştirin: çekilmiş cam kılcal pipetler (pipetlerin nasıl çekileceği ile ilgili referans10'a bakın), küçük makaslar, küçük biyolojik tehlike kesici alet atık kabı, mikrolitrelik pipetleyici ve pipet uçları, 2x kesilmiş kare parafin film parçaları, elektrot jeli, elektrotlar, mikroenjektör tutucu ve DNA plazmit karışımı (bkz.</li>
	<li>Aşağıdaki ataşmanları, belirtildiğinde ameliyat masasındaki veya zemindeki ekipmanın üzerine yerleştirin: mikroenjektör kontrol paneli, makineye takılı tutucu ve fiş, mikroenjektör tutucuyu yana tutmak için stand (lehimleme yardımcısı), mikroenjektör ayak pedalı (yerde), makineye bağlı elektrotlar ve elektrot ayak pedalı (zeminde) (bkz. NOT: Elektrot ayak pedalı, kullanım sırasını hatırlatmak için mikroenjektör ayak pedalının sağına yerleştirilmiştir.</li>
	<li>Mikroenjektör ve elektrot kontrol panellerini açın.<ol><li>Mikroenjektör üzerindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin: plazmit karışımının nasıl alındığına bağlı olarak basınç 220-450 hPa arasında olmalıdır.</li>
		<li>Elektrot panelindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin. NOT: Mevcut deney (ve beyin tümörü modellerimizin çoğu) için, 120 V'luk (50 ms; 950 ms ile ayrılmış) beş darbe kullanılmıştır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ameliyat öncesi hazırlık
<ol><li>Plazmid karışımını mikroenjektörde hazırlayın.<ol><li>Çekilmiş bir cam kılcal pipeti alın ve mikroenjektör tutucusuna yerleştirin. Yerinde tutmak için ucun vidalandığından emin olun.</li>
		<li>Mikroenjektör tutucuyu bir elinizle, küçük makası diğer elinizle tutun; Pipetin ucunu küçük bir keskin biyolojik tehlike kabının üzerine koyun. Makas kapalıyken, uzatılmış cam kılcal pipete hafifçe bastırın. Bükümün görüldüğü yerde, açıklıktan yaklaşık 2 mm uzakta kesin. Kesim başarılı görünüyorsa, dikkatlice yana yerleştirin.</li>
		<li>Piyasada bulunan plazmid karışım tüpünü ameliyat masasına düz bir şekilde yerleştirin ve açın. Plazmid karışımını hazırlarken sabit tutmak için pipet ucu kutusunu veya başka bir öğeyi tüpün tabanının arkasına yerleştirin. Mikroenjektör hattına bağlı cam pipeti masanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve ucun tüpün dibine yakın karışımda iyice olduğundan emin olarak plazmit karışımının tüpüne yavaşça yerleştirin. NOT: Doğal yerçekimi emişi nedeniyle, plazmit karışımı emişi, aktif olarak çekilmeden önce cam pipette başlayacaktır.</li>
		<li>Plazmit karışımındaki cam pipetin ucuyla, çekilen miktarı artırmak için mikroenjektör panelini kullanın. 0'dan başlayarak, sağ düğmeyi çevirin ve -60'a doğru negatif yönde çevirin - bu, plazmit karışımını cam pipete getirecektir. Sadece ~ 1 inç plazmit karışımı getirin. Düğmeyi tekrar 0'a çevirin ve ardından pipet ucunu karışımdan çıkarın. NOT: Negatif yöndeyken pipet ucunu karışımdan çıkarmayın, çünkü bu, karışımı mikro enjektöre ve muhtemelen boruya fırlatacaktır.</li>
		<li>Karışımı bir parafin film şeridine enjekte ederek bir enjeksiyondaki karışım miktarını test edin. Karışımı parafin filmine enjekte etmek için ayak pedalını kullanın ve bir kez basın. Tam olarak 1 μL olup olmadığını görmek için karışımı parafin filmine almak için 1 μL'ye ayarlanmış pipetleyiciyi kullanın. NOT: 1 μL'den biraz daha azsa, mikroenjektörün basıncı artırılabilir. Basınç 450 hPa'ya yaklaşıyorsa ve hala 1 μL'den azsa, cam pipet açıklığı çok küçüktür ve daha fazla kesilmesi gerekecektir. Kırpmadan önce plazmit karışımının tekrar tüpe yerleştirilmesi önerilir. Buna rağmen, makas üzerinde hala bir kalıntı karışım olacaktır, bu nedenle kalan karışımı çıkarmak için makası daha sonra DNase ile iyice temizlemek zorunludur. Enjeksiyon 1 μL'den fazlaysa, yeni bir çekilmiş cam pipetin kullanılması ve kesilmesi gerekecektir. Test miktarı tam olarak 1 μL olduğunda, cam pipet ucu doğru boyuttadır.</li>
		<li>Prosedür için ek plazmit karışımı veya çekilen cam pipete yaklaşık 2-3 inç çekmek için 2.1.4 adımını tekrarlayın. Karışımın, ucunun görülemeyeceği, mikroenjektörün içine çok fazla girmediğinden emin olun. NOT: Plazmid karışımını çizerken hava kabarcıklarından kaçınmak çok önemlidir. Kabarcıklar varsa, plazmit karışımını çekilen cam pipetten çıkararak ve yeniden başlayarak bu adımı yeniden yapmak gerekir. Mevcut hava kabarcıkları, yavrunun ventrikülüne enjekte edilirken aşağıdaki adımlara zarar verecektir.</li>
		<li>Plazmid karışımı çekilmiş cam pipette hazırken, hazırlanan pipeti yanlışlıkla dokunmamak/çarpmamak için lehimleme yardımı standının yan tarafına ve yoldan uzağa yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hayvanları deney için hazırlayın.<ol><li>Anestezi uygulayan yavrular için bir buz kovası hazırlayın. Eritmek için buz kovasına su ekleyin ve anestezi tutucuyu (örn. pipet kutusu üstü) soğutmaya yardımcı olun.</li>
		<li>Soğuması için kutunun üstünü erimiş buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Yavruları kafesten dikkatlice çıkarın ve buzun üzerinde kalan soğutulmuş kutunun üstüne yerleştirin. Soğutma işlemine yardımcı olmak için alt kısma gevşek bir şekilde başka bir üst kısım yerleştirin.</li>
		<li>2-3 dakika sonra yavruları kontrol edin. Yüzüstü pozisyonda kalarak yavruları birbirinden ayırın. NOT: Yavrular kıvranacak, ancak soğuk anestezi devreye girdiğinde bu yavaşlayacaktır. Yavruların kolay görüntülenmesi için kutunun üst kısmı kapalı bırakılabilir.</li>
		<li>Uygun anestezi olup olmadığını kontrol etmek için yavrunun kuyruğunu sıkıştırın ve bir reaksiyon arayın. Bir reaksiyon varsa, 2.2.4 adımını tekrarlayın. Gıcırtı yoksa veya çok az hareket yapılırsa, yavru prosedür için hazırdır. NOT: Fareler, işlemden sonra iyileşme yeteneklerini etkileyeceğinden uzun süre buz üzerinde tutulmamalıdır. Bir seferde sadece anestezi altındayken hem enjekte edilebilen hem de elektropore edilebilen yavru sayısı buza konulmalıdır; Tecrübe ile daha büyük sayılar yapılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. DNA plazmit karışımının beyin ventrikülüne mikroenjeksiyonu
<ol><li>Ventral pozisyonda masanın üzerine bir yavru yerleştirin.</li>
	<li>Kafatası dikişlerini deriden görselleştirmek için başın arkasını hafifçe geriye doğru çekin. Kafatasında lambda bulun. Ventrikül/enjeksiyon bölgesi lambda ve gözün ortasında olacaktır. NOT: Lambda, sagital ve lambdoid sütürlerin kesiştiği yerdir. Fare kafatasındaki lambdanın tanımlanması için referans11'e bakın.</li>
	<li>Cam pipet ucuyla cildi dik bir açıyla delin (pipet tavana doğru dümdüzdür). Kafatasına bastırırken hafif bir içbükey girinti ve ilk direnç gözlemleyin. Delindikten ve cam pipet ucu içbükey girintiden geçtikten sonra uygun enjeksiyon seviyesine ulaşılır.</li>
	<li>Cam pipet ucunu yerinde tutun ve 1 μL plazmit karışımı enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına bir kez basın. NOT: Enjeksiyonun başarılı olduğunu net bir şekilde görmenin iki yolu vardır. İlk olarak, başka bir laboratuvar üyesinin plazmit karışımının enjekte edilirken cam pipete inmesini izlemesini sağlayın. Ayrıca, plazmit karışımında hızlı yeşil veya başka bir boya kullanılıyorsa, boya enjekte edildikten sonra derinin altındaki ventrikülde gözle görülür şekilde yayılır ve bir cerrahi lambaya tutulduğunda kolayca görülebilir.</li>
</ol>4. Elektroporasyon
<ol><li>Masanın üzerine bir parça parafin filmi (bir kare) yerleştirin ve filmin üstündeki elektrot jelini sıkın. Her bir kürek üzerine bol miktarda fırçalayarak elektrot kanatçıklarını elektrot jeli ile kaplayın. Damlayan fazla jel bir kağıt havlu üzerinde kaydırılabilir. NOT: İlk EP'den sonra, her bir kürekten gelen jelin diğer tarafa temas etmesine izin vermeyin. Bu, yükü aktarır ve yavrunun kafasına uygulanırken cızırtılı bir ses duyulabilir. Bu, bir elektrottan yavrunun kafasındaki jel, diğerinden gelen jel ile temas ederse de olur. DİKKAT: Elektroporasyon sırasında parmakları küreklerden uzak tutmaya özen gösterilmelidir.</li>
	<li>Yavrunun vücudunu bir elinizle (tipik olarak baskın olmayan el) tutun ve parmakları başın arkasında tutun. NOT: Sağ elini kullanıyorsa, yavruyu sol elinizle, elektrotları sağ elinizle tutmak en kolay yoldur. Solaksanız, tam tersini yapın.</li>
	<li>Pozitif elektrot başın dışında ventrikülün hedeflendiği yerde olacak şekilde uygun pozisyonda olduklarından emin olmak için elektrotları yavrunun kafasına yaklaştırın (örneğin, sol ventrikülü hedefliyorsanız, pozitifi yavrunun sol tarafına ve negatifi yavrunun sağ tarafına yerleştirin). Elektrotları yerleştirirken, başın yerine kaldırılmasına yardımcı olmak için bir parmağınızı (tipik olarak başparmağınızı) vücudun dorsal tarafında/boynun arkasında, başın arkasına hafifçe kaydırın.</li>
	<li>Kuyruğu sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin ve sadece yavru uygun anestezi düzlemindeyse elektroporasyona devam edin. Elektrot küreklerini fare kafasının rostral kısmındaki hafifçe sıkın ve gözlerin üzerine yerleştirin. Elektroporasyonu başlatmak için elektrot ayak pedalına bir kez basın. Bu protokol, 120 V'luk beş darbe kullanır (50 ms, 950 ms ile ayrılmış); Her nabız duyulabilir.<ol><li>Her darbede, elektrot kanatlarını saat yönünün tersine hafifçe döndürün, böylece pozitif kanat başın tepesine doğru hareket eder. NOT: Uygun elektroporasyon ile, her nabızda fare yavrusunun vücudunun seğirdiğini hissedecek/görecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Son darbeden sonra kürekleri çıkarın ve yana yerleştirin. Yavruyu temiz bir kağıt havluya taşıyın ve başka bir laboratuvar üyesinin jeli yavrunun kafasından temizlemesini ve bir kağıt havlu "teknesi" üzerindeki bir ısı lambasının altına yerleştirmesini sağlayın. NOT: Isı lambasının yavrulara çok yakın olmadığından emin olun. Bu adımda başka bir laboratuvar üyesinin yardım ettiğinden emin olun ve yavrulara sürekli göz kulak olun. Yavruların ısısını artırmak için genellikle yavruları ısı lambasının altında elinde tutmaya yardımcı olur. Yavrunun karnına hafifçe masaj yapmak da iyileşmeye yardımcı olabilir.</li>
	<li>Vücutları sağlıklı pembemsi bir renge sahip olduğunda ve hafif bir kuyruk tutamına gıcırtılı bir tepki verdikten sonra yavruları ev kafesine geri koyun. NOT: Onları kafese geri koymadan önce, az miktarda ev kafesi yatak malzemesi alın ve kafes kokusu için yavruları hafifçe fırçalayın. Yavruları yatak malzemesinin altındaki kafese geri koyun ve bekleme odasına geri dönün.</li>
</ol>5. Ameliyat sonrası adımlar
<ol><li>Kullanılmayan plazmid karışımını mikroenjektör cam pipetinden tüpe geri koyun. Yeterli karışım kaldıysa, bu gelecekteki prosedürlerde kullanılabilir. -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Elektrot küreklerindeki jeli kağıt havluyla silin.</li>
	<li>Tüm ekipman parçalarını orijinal yerlerine geri koyun. NOT: Plazmit karışımı alındıktan sonra cam pipet ucunu kesmek için makas kullanılmışsa, DNase çözeltisi ile iyice temizlemek için makası dışarıda bırakın.</li>
	<li>Masaya kimyasal bir dezenfektan püskürtün, ardından silin, ardından %70 etanol püskürtün, ardından tekrar silin.</li>
</ol>

Plazmid DNA'nın Elektroporasyon Tabanlı Verilmesi ile İn Vivo Beyin Tümörü Modellemesi

<ol>
	<li>Brabetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biobank+of+patient-derived+pediatric+brain+tumor+models.">A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).</li><li>Hadad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies.">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+models+recapitulate+heterogeneity+of+molecular+signatures+and+drug+response+in+pediatric+high-grade+glioma.">Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma.</a> Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).</li><li>Szatm&#225;ri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+characterization+of+the+mouse+glioma+261+tumor+model+for+experimental+glioblastoma+therapy.">Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy.</a> Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).</li><li>Genoud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+to+anti-PD-1+and+anti-CTLA-4+immune+checkpoint+blockade+in+SB28+and+GL261+mouse+glioma+models.">Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models.</a> Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).</li><li>Reardon, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Nivolumab+vs+Bevacizumab+in+patients+with+recurrent+glioblastoma:+the+CheckMate+143+phase+3+randomized+clinical+trial.">Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial.</a> JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).</li><li>Wainwright, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+therapeutic+efficacy+utilizing+combinatorial+blockade+against+IDO,+CTLA-4,+and+PD-L1+in+mice+with+brain+tumors.">Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors.</a> Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).</li><li>Kim, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+somatic+mouse+mosaics+with+locus-specific,+stably+integrated+transgenic+elements.">Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements.</a> Cell. 179 (1), 251-267 (2019).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+assembly,+and+transduction+of+transgenic+elements+using+mosaic+analysis+with+dual+recombinase+(MADR).">Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR).</a> STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).</li><li>White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intertwined+evolution+and+development+of+sutures+and+cranial+morphology.">The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ets+factors+regulate+neural+stem+cell+depletion+and+gliogenesis+in+Ras+pathway+glioma.">Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma.</a> Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).</li><li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice:+new+tools+to+tackle+old+problems.">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li><li>Feng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+loss+of+function+analysis+in+cerebellar+granule+cells+using+in+utero+electroporation-based+gene+transfer.">CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-in+by+CRISPR/Cas9+and+cell+sorting+in+macrophage+and+T+cell+lines.">Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).</li><li>Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells+in+utero+electroporation+or+viral+stereotaxic+injection.">Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).</li><li>Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+for+glioblastoma:+is+it+working.">Therapy for glioblastoma: is it working.</a> Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Plazmid DNA'nın elektroporasyona dayalı iletimi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kullanılana benzer, ancak viral transdüksiyonun hızı, lokalizasyonu ve verimliliği ile moleküler biyolojinin in vivo kullanımına izin verir 8,13,14. Bununla birlikte, ikincisi ile birlikte, güvenlik endişeleri ve bağışıklık tepkileri gelir. Plazmid DNA'nın EP iletimini kullanan modelleme sistemimizde, cam kıl...

Murin beyin tümörü modelleri, beyin tümörü oluşum ve tedavi mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Mevcut modeller tipik olarak, uygun immünoterapi çalışmalarını engelleyen immün yetmezliği olan fareler kullanılarak, sınırlı sayıda sürücü mutasyonuna veya hastadan türetilen ksenogreft modellerine dayalı olarak, yaygın olarak kullanılan tümör hücre hatlarının hızla üretilen deri altı veya ortotopik transplantasyonlarını içerir 1,2,3,4. Ek olarak, bu klinik öncesi sonuçlar yanlış pozitiflere yol açabilir, çünkü bu tür modeller tedaviye yanıt olarak dramatik, çoğu zaman iyileştirici etkiler gösterebilir, ancak bu klinik 2,5,6,7'ye dönüşmez. Hasta mutasyon imzalarını daha fazla yansıtan, genetiği değiştirilmiş klinik öncesi fare modellerini hızlı bir şekilde üretme yeteneğine sahip olmak, klinik öncesi sonuçların geçerliliğini artırmak için zorunludur.
Hem fonksiyon kaybı (LOF) hem de fonksiyon kazancı (GOF) mutasyonlarını indüklemek için DNA plazmitlerinin elektroporasyon (EP) tabanlı iletimi, bu tür modellerin üretilmesine izin verir. Çift rekombinaz aracılı kaset değişimi veya MADR8 ile mozaik analizi adı verilen GOF sürücü mutasyonlarının daha kesin bir temsili için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin (veya genlerin) somatik hücrelerde kontrollü, lokusa özgü bir şekilde ekspresyonuna izin verir8. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gibi diğer moleküler araçlarla kombinasyon halinde, fare beyin tümörü modelleri geliştirmek için farklı hasta mutasyonları birleştirilebilir. Bu yöntem, gliomlar ve ependimomlar8 dahil olmak üzere farklı pediatrik beyin tümörlerinin yanı sıra glioblastoma (GBM) gibi yetişkin beyin tümörü modelleri için kullanılmıştır.
EP tümör modelleme yöntemi bir nakil kadar yaygın olmasa da, aşağıdakiler şimdiye kadar bu modelleme sisteminin kolaylığını ve yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. mTmG fareleri, MADR-plazmid DNA 8,9'un eklenmesi için kullanılır. Bu sistem, donör DNA plazmidinin (yani, ilgilenilen GOF geni) daha sonra eklenmesi için Rosa26 lokusunda bulunan loxP ve Flp rekombinaz hedef (FRT) bölgelerinin rekombinasyonuna izin verir8,9. Aşağıdaki protokol, gayretli bir uygulamadan sonra bu yöntemin basitliğini ve fare beyin tümörü modellerini otokton, tutarlı bir şekilde geliştirme yeteneğini göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1-2.5 &#181;L 1-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L 1-channel pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAZap PCR DNA Degradation Solutions</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 830 Square Porator Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Gel</td>
			<td>Parker Labs</td>
			<td>PLI152CSZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green Dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helping Hands Soldering Aid</td>
			<td>Pro&#39;sKit</td>
			<td>900-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors, 4.5&#34; Straight Sharp</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Strain: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>&#160;JAX: 007676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>16Y894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>129419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharps container, 1-quart</td>
			<td>Uline</td>
			<td>S-15307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td>Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimoba Tablet Solution</td>
			<td>Quip Laboratories</td>
			<td>VIMTAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoWorks Micropipette Holder</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BR-MH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling brain tumors in vivo using electroporation-based delivery of plasmid dna representing patient mutation signatures

Tümör modelleri, yeni ve daha etkili tedavilerin araştırılması açısından beyin tümörlerinin klinik öncesi testleri için kritik öneme sahiptir. İmmünoterapiye büyük ilgi duyulduğundan, beyindeki tümör ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve tedaviye yanıtlarını incelemek için tutarlı, klinik olarak uygun, immün yetmezliği olan bir fare modeline sahip olmak daha da kritiktir. Klinik öncesi modellerin çoğu, yerleşik tümör hücre hatlarının ortotopik transplantasyonunu kullanırken, burada sunulan modelleme sistemi, bölünen nöral öncü hücrelere (NPC'ler ) eklenen DNA yapılarından kademeli ancak etkili bir gelişimde hastaya özgü tümör mutasyonlarının "kişiselleştirilmiş" bir temsiline izin verir. DNA yapıları, sürücü mutasyonlarının tek kopyalı, somatik mutajenezine izin veren çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) yöntemiyle mozaik analizine sahiptir. Doğum ile 3 günlük arasındaki yeni doğan fare yavruları kullanılarak, NPC'ler lateral ventrikülleri kaplayan bu bölünen hücrelerden yararlanılarak hedeflenir. DNA plazmitlerinin (örneğin, MADR türevi, transpozonlar, CRISPR'ye yönelik sgRNA) ventriküllere mikroenjeksiyonunu, başın rostral bölgesini çevreleyen kürekler kullanılarak elektroporasyon takip eder. Elektriksel stimülasyon üzerine DNA, genoma entegre olma potansiyeli ile bölünen hücrelere alınır. Bu yöntemin kullanımı, en yaygın malign beyin tümörü olan glioblastoma dahil olmak üzere hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörlerinin geliştirilmesinde başarıyla gösterilmiştir. Bu makale, genç fare yavrularının uyuşturulması, plazmit karışımının mikroenjeksiyonu ve ardından elektroporasyon dahil olmak üzere bu tekniği kullanarak bir beyin tümörü modeli geliştirmenin farklı adımlarını tartışmakta ve göstermektedir. Bu otokton, bağışıklığı yeterli fare modeli ile araştırmacılar, etkili kanser tedavisini iyileştirme ve inceleme çabalarında klinik öncesi modelleme yaklaşımlarını genişletme yeteneğine sahip olacaklar.

Murine brain tumor models are crucial for understanding the mechanisms of brain tumor formation and treatment. Current models typically include rapidly produced subcutaneous or orthotopic transplantations of commonly used tumor cell lines, based on a limited number of driver mutations or patient-derived xenograft models, using immunodeficient mice that hinder proper immunotherapy studies1,2,3,4. Additionally, these preclinical results can lead to false positives, in that such models can exhibit dramatic, oftentimes curative effects in response to therapy, but this does not translate to the clinic2,5,6,7. Having the ability to rapidly produce genetically engineered preclinical mouse models that are more reflective of patient mutation signatures is imperative for improving the validity of preclinical results.
Electroporation (EP)-based delivery of DNA plasmids to induce both loss of function (LOF) and gain of function (GOF) mutations allows for the generation of such models. We developed a method for an even more precise representation of GOF driver mutations called mosaic analysis with dual-recombinase-mediated cassette exchange, or MADR8. This method allows for the expression of a gene (or genes) of interest in a controlled, locus-specific manner in somatic cells8. In combination with other molecular tools, such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), different patient mutations can be combined to develop mouse brain tumor models. This method has been used for different pediatric brain tumors, including gliomas and ependymomas8, as well as adult brain tumor models, such as glioblastoma (GBM).
While the EP method of tumor modeling is not as common as a transplant, the following demonstrates heretofore the ease and high reproducibility of this modeling system. mTmG mice are used for the insertion of the MADR-plasmid DNA8,9. This system allows for the recombination of loxP&#160;and Flp recombinase target (FRT) sites located at the Rosa26 locus for subsequent insertion of the donor DNA plasmid (i.e., GOF gene of interest)8,9. The following protocol demonstrates the straightforwardness of this method after diligent practice, and the ability to develop mouse brain tumor models in an autochthonous, consistent manner.

Yazar Spotlight: Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyon Tabanlı Dağıtımını Kullanarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi  

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

The technique focuses on modeling patient mutation profiles of glioblastoma in the immunocompetent mouse model and how these different mutations are influencing the tumor microenvironment and response to treatment. Genomic and single cell sequencing identify that the genetic driver mutations of glioblastoma are associated with the aggressiveness of cancer and components of the tumor microenvironment such as the immune cell population. Glioblastoma mouse models in preclinical trials show great success with immunotherapy leading to curative results and no sign of tumor growth after treatment.However, these effects are not reflected in patients for outcome or survival. This protocol recapitulates patient tumor mutation profiles of glioblastoma in the immunocompetent mouse model, allowing gradual autochthonous tumor growth and better prediction of treatment efficacy, especially with immunotherapy. This modeling system integrates DNA plasmids into the genome through electroporation of immunocompetent mice.It avoids the use of viruses and transplanting thousands of tumor cells, both of which can have their own immune effects, confounding downstream results. Utilizing an immunocompetent mouse model that recapitulates patient mutation profiles allows for a more accurate assessment of treatment outcomes, preventing the laborious task of taking false positive results to the clinic.

Yukarıda açıklanan protokol, hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörü fare modellerini başarılı bir şekilde geliştirmek için kullanılmıştır ve ilki Kim ve ark.8'de ayrıntılı olarak yayınlanmıştır. Uygun teknik ve plazmit tasarımının dikkatli bir şekilde planlanması ile tümörlerin EP gelişimindeki başarı tipik olarak %100'dür. Histoloji, bir raportör protein kullanıldığında başarılı DNA plazmit eklemesini kontrol etmenin en hızlı ve en kolay yoludur. B...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures at JoVE.com

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Tumor models are critical for the preclinical testing of brain tumors in terms of exploring new, more efficacious treatments. With significant interest in ...

Teknik, immünokompetan fare modelinde glioblastomun hasta mutasyon profillerinin modellenmesine ve bu farklı mutasyonların tümör mikroçevresini ve tedaviye yanıtı nasıl etkilediğine odaklanmaktadır. Genomik ve tek hücre dizilimi, glioblastomun genetik sürücü mutasyonlarının, kanserin agresifliği ve bağışıklık hücresi popülasyonu gibi tümör mikroçevresinin bileşenleri ile ilişkili olduğunu tanımlar. Klinik öncesi çalışmalardaki glioblastoma fare modelleri, iyileştirici sonuçlara yol açan ve tedaviden sonra tümör büyümesi belirtisi olmayan immünoterapi ile büyük başarı göstermektedir.Bununla birlikte, bu etkiler sonuç veya sağkalım için hastalara yansımaz. Bu protokol, immünokompetan fare modelinde glioblastomun hasta tümör mutasyon profillerini özetleyerek, kademeli otokton tümör büyümesine ve özellikle immünoterapi ile tedavi etkinliğinin daha iyi tahmin edilmesine olanak tanır. Bu modelleme sistemi, immünokompetan farelerin elektroporasyonu yoluyla DNA plazmitlerini genoma entegre eder.Virüslerin kullanımını ve her ikisi de kendi bağışıklık etkilerine sahip olabilen binlerce tümör hücresinin nakledilmesini önler ve aşağı akış sonuçlarını karıştırır. Hasta mutasyon profillerini özetleyen immünokompetan bir fare modelinin kullanılması, tedavi sonuçlarının daha doğru bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak kliniğe yanlış pozitif sonuçlar almanın zahmetli görevini önler.

modeling-brain-tumors-vivo-using-electroporation-based-delivery

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Modeling Brain Tumors In Vivo Using Electroporation-Based Delivery of Plasmid DNA Representing Patient Mutation Signatures

984 Görüntüleme.  Cedars-Sinai Medical Center. Teknik, immünokompetan fare modelinde glioblastomun hasta mutasyon profillerinin modellenmesine ve bu farklı mutasyonların tümör mikroçevresini ve tedaviye yanıtı nasıl etkilediğine odaklanmaktadır. Genomik ve tek hücre dizilimi, glioblastomun genetik sürücü mutasyonlarının, kanserin agresifliği ve bağışıklık hücresi popülasyonu gibi tümör mikroçevresinin bileşenleri ile ilişkili olduğunu tanımlar. Klinik öncesi çalışmalardaki glioblastoma fare modelleri, i...

Video: Yazar Spotlight: Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyon Tabanlı Dağıtımını Kullanarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi  