Bu çalışma Padova Üniversitesi Farmasötik ve Farmakolojik Bilimler Bölümü (PRIDJ-BIRD2019) tarafından desteklenmiştir.

1. Nükleik asit ve kimyasal prob hazırlama
<ol><li>Nükleik asitler NOT: "TBA" olarak adlandırılan oligonükleotid, jel üzerinde görselleştirmeyi sağlamak için florofor 5-karboksifloresein (FAM) tarafından 3'-ucunda etiketlenen 15-mer DNA dizisi 5'-GGT-TGG-TGT-GGT-TGG-3'dür. Etiketlenmemiş oligonükleotid "cTBA", DNA tamamlayıcı dizisi 5'-CCA-ACC-ACA-CCA-ACC-3'dür. TBA ve cTBA, Tablo 1'de gösterildiği gibi üç farklı yapıyı elde etmek için kullanılır.<ol><li>Steril tek kullanımlık malzemeler elde etmek ve kontaminasyonu önlemek için otoklav uçları ve 0,5 mL tüpler.</li>
		<li>Her oligonükleotidi ultra saf suda 100 μM'lik bir nihai konsantrasyona çözündüren stok çözeltileri hazırlayın. Üretici tarafından sağlanan 260 nm'de sönme katsayısını kullanarak ultraviyole görünür (UV-Vis) spektrofotometre ile tam oligonükleotid konsantrasyonunu belirleyin. NOT: Sönme katsayıları: TBA ve cTBA için sırasıyla 164.300 M-1 cm-1 ve 138.600 M-1 cm-1 kullanılmıştır.</li>
		<li>TBA ve cTBA stok çözeltilerini -20 °C'de saklayın (bu koşullarda aylarca).</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik B-CeP 1 NOT: B-CeP 1 bileşiği, daha önce bildirildiği gibisentezlenir 6.<ol><li>B-CeP 1 stok çözeltisini ~10 mM'de hazırlayın. Çeker ocakta bulunan analitik bir terazi kullanarak ~1 mg liyofilize bileşiği tartın ve %100 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündürün.</li>
		<li>Kullanılan gerçek bileşik miktarına ve DMSO'ya (d = 1.1 g/cm3) dayalı olarak tam bileşik konsantrasyonunu hesaplayın. NOT: Bileşiği her zaman eldivenlerle kullanın (hem liyofilize edildiğinde hem de DMSO içinde çözündüğünde)13,14.</li>
	</ol></li>
</ol>Tablo 1: Bu protokolde kullanılan oligonükleotid yapıları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373_Table%201%20(5).xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Nükleik asit yapılarının katlanması
<ol><li>Tamponların hazırlanması<ol><li>Bir BPE tampon çözeltisi (bifosfat-etilendiamintetraasetik asit [EDTA], 5x: 2 mM NaH2PO4, 6mM Na2HPO 4, 1 mMNa2EDTA, pH 7.4) ve ultra saf suda 500 mM KCl'lik bir çözelti hazırlayın. Çözeltileri 0,22 μm gözenek boyutu filtrelerinden geçirin. NOT: En iyi sonuçlar için taze hazırlanmış solüsyonlar kullanın. BPE tamponu 4 °C'de 15 güne kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>G4-TBA, ssTBA ve dsTBA numunelerinin ısıyla yeniden katlama prosedürü ile katlanması NOT: G4 yapısını (G4-TBA) katlamak için potasyum katyonları gereklidir. Kontrollerin katlama çözeltisine potasyum katyonları eklemeyin ssTBA ve dsTBA.<ol><li>1x BPE ve 100 mM KCl'de 40 μL 4 μM G4-TBA çözeltisi hazırlayın. Tüpü 5 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtarak oligonükleotid G4-TBA çözeltisini denatüre edin ve TBA'nın G-dörtlülerine katlanmasını sağlamak için yavaşça oda sıcaklığına (RT) soğutun.</li>
		<li>1x BPE'de 40 μL 4 μM ssTBA çözeltisi hazırlayın. TBA'yı tek sarmallı formda katlamak için adım 2.2.1'de belirtildiği gibi ısıyla yeniden katlama prosedürünü gerçekleştirin.</li>
		<li>1x BPE'de eşmolar miktarlarda TBA ve cTBA'yı karıştırarak 40 μL'lik 4 μM dsTBA çözeltisi hazırlayın. TBA'nın tamamlayıcı dizisi cTBA'ya tavlanması ve TBA'nın çift sarmallı formunu oluşturması için yukarıda belirtildiği gibi ısıyla yeniden katlama prosedürünü gerçekleştirin (adım 2.2.1). NOT: Her bir katlama çözeltisinin nihai hacmi, her bir numune için 5 μL 4 μM çözeltiye ihtiyaç duyulacağı göz önüne alındığında, sondalama reaksiyonları için numune sayısına dayanmaktadır. Pipetleme hatalarını önlemek için her çözeltiden biraz fazla hacim hazırlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Reaksiyonların araştırılması
NOT: Sondalama reaksiyonları, ısıyla yeniden katlama prosedüründen hemen sonra yapılmalıdır.
<ol><li>G4-TBA, ssTBA ve dsTBA'nın katlama çözeltileri RT'ye soğuduğunda, kısa spinli bir santrifüjleme gerçekleştirin (RT'de 5-8 saniye boyunca 7.000 × g ) ve problama reaksiyonlarını başlatın.</li>
	<li>21 adet boş 0,5 mL otoklavlanmış tüp hazırlayın. Bunları, Tablo 2'de bildirildiği gibi, laboratuvar numuneleri için rafta her biri yedi tüpten oluşan üç set halinde düzenleyin. NOT: Her sütun seti, G4-TBA, ssTBA ve dsTBA olmak üzere üç farklı TBA katlama koşuluna karşılık gelir. Her sıra üç farklı inkübasyon süresine karşılık gelir. Kolon içindeki her hücre, son B-CeP 1 prob konsantrasyonuna karşılık gelir (Tablo 2). Tüpleri açıkça etiketlediğinizden emin olun.</li>
	<li>Her tüpe 3 μL ultra saf su ekleyin.</li>
	<li>İlk setin her tüpüne 5 μL katlanmış G4-TBA ekleyin (adım 3.2). İkinci setin her tüpüne 5 μL katlanmış ssTBA ekleyin. Üçüncü setin her tüpüne 5 μL katlanmış dsTBA ekleyin.</li>
	<li>B-CeP 1 stok çözeltisini ultra saf suda 250 μM ve 25 μM'ye seyreltin. NOT: B-CEP 1 kimyasal probunun dilüsyonları taze olarak hazırlanmalı ve su ile rekabet eden reaksiyonlardan kaçınmak için DNA substratı ile hemen reaksiyona sokulmalıdır.</li>
	<li>Numunelere 2 μL uygun B-CeP 1 seyreltmesi (25 μM ve 250 μM) ekleyin. Bileşiğin yokluğunda farklı katlanmış TBA'ların analizi için bileşiği üç kontrol numunesinde (C) ultra saf su ile değiştirin. Tüm numuneleri 37 °C'de inkübe edin.</li>
	<li>1 saat, 4 saat ve 15 saat inkübasyondan sonra, tüpleri bir sonraki adıma kadar -20 °C'ye yerleştirerek reaksiyonu durdurun. NOT: Numuneler bu koşullarda birkaç gün saklanabilir.</li>
	<li>Numuneleri vakumlu santrifüjde kurutun. NOT: Kurutulmuş numuneler, PAGE analizine geçmeden önce -20 °C'de haftalarca saklanabilir.</li>
</ol>Tablo 2: Sondalama reaksiyonları için numuneler (yapılar, prob konsantrasyonları ve inkübasyon süresi). Her sütun kümesi, üç farklı TBA katlama koşuluna (G4-TBA, ssTBA ve dsTBA) karşılık gelir. Her sıra üç farklı inkübasyon süresine (1, 4, 15 saat) karşılık gelir. Kolon içindeki her hücre, son B-CeP 1 prob konsantrasyonuna (5 veya 50 μM) karşılık gelir. Her set için kontrol (C), bileşik yokluğunda daha uzun süre (15 saat) inkübe edilen farklı katlanmış TBA'ların bir örneğine karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373_Table%202%20(3).xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Yüksek çözünürlüklü SAYFA
<ol><li>Denatüre edici poliakrilamid çözeltisinin hazırlanması NOT: Önceden 500 mL %20 denatüre edici poliakrilamid jel çözeltisi hazırlayın. Her deney için bu çözeltinin yaklaşık 80 mL'si kullanılacaktır. Çözeltiyi RT'de saklamak için kehribar rengi bir cam şişe kullanın veya bir cam şişeyi alüminyum folyo ile kapatın. DİKKAT: Poliakrilamid nörotoksiktir. Jel hazırlama ve dökmenin tüm aşamalarında eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Polimerize akrilamid'i kontamine malzemeler için uygun bir kutuya atın.<ol><li>1 L'lik bir beherde 210 g üre tartın. 250 mL %40 akrilamid/bisakrilamid (19/1) çözeltisi ve 50 mL 10x TBE (890 mM Tris-HCl, 890 mM borat, 20 mM EDTA, pH 8) ekleyin.</li>
		<li>Beheri bir karıştırma plakasına yerleştirin ve çözeltiyi bir karıştırma çubuğuyla karıştırın. Sıçramayı ve kirlenmeyi önlemek için karıştırma sırasında kabı alüminyum folyo ile örtün.</li>
		<li>Üre tamamen eriyene ve çözelti berraklaşana kadar çözeltiyi karıştırın. NOT: Bu adım birkaç saat sürebilir. Ürenin çözünmesini teşvik etmek için, istenen nihai hacmin ötesine geçmeden küçük bir su alikotu ekleyin.</li>
		<li>Karıştırma çubuğunu çıkarın. Çözeltiyi bir silindire dökün ve 500 mL'lik kesin bir nihai hacme kadar su ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Jel aparatının kurulması<ol><li>İki plakayı (biri çentikli diğeri çentiksiz) %70 etanol ile temizleyin, kurumasını bekleyin ve ardından plakalara bir dimetildiklorosilan çözeltisi uygulayın. NOT: Jel sandviç parçalara ayrıldığında jelin plakalardan birinden salınmasına yardımcı olmasına rağmen silanizasyon atlanabilir. DİKKAT: Silanizasyon solüsyonunu eldivenlerle tutun ve bu solüsyonla plaka işlemini çeker ocakta gerçekleştirin.</li>
		<li>0.4 mm'lik ara parçaları uzun plakanın uzun kenarları boyunca yerleştirin, kısa plakayı diğerinin üzerine yerleştirin ve iki plakayı alttan hizalayın.</li>
		<li>Üst kısım hariç tüm kenarlar boyunca birden fazla kağıt bant katmanı yerleştirin.</li>
		<li>Döküm sırasında sızıntıları önlemek için, jelin dibine ek bir bant tabakası ekleyin.</li>
		<li>Cam sandviçin kenarlarını temiz kelepçelerle klipsleyin.amptedarikçinin talimatlarını izleyerek (farklı tedarikçiler biraz farklı aparatlar, sandviç kelepçeler ve contalar kullanır).</li>
	</ol></li>
	<li>Jeli dökmek NOT: Poliakrilamid polimerizasyonu sıcaklığa duyarlı olduğu için jeli RT'de (25 °C) dökün.<ol><li>Bir behere 80 mL önceden hazırlanmış denatüre edici poliakrilamid çözeltisi (adım 4.1), 450 μL %10 m/V amonyum persülfat (APS) çözeltisi ve 45 μL tetrametiletilendiamin (TEMED) kullanımdan hemen önce dökün.</li>
		<li>Çözeltiyi karıştırın ve 50 mL'lik bir şırınga kullanarak cam plakaların arasına hızla dökün. Kabarcıkları önleyerek tarağı cam plakalar arasına istenen sayıda kuyucukla sokun. Gerekirse sandviçi tamamen doldurmak için jel solüsyonu ekleyin. Aşağı bastırmak ve kuyuların eşit dağılımını sağlamak için tarağın üzerine dört kelepçe yerleştirin.</li>
		<li>Jelin en az 45 dakika polimerize olmasına izin verin.</li>
	</ol></li>
	<li>Jeli çalıştırmak<ol><li>Polimerizasyondan sonra, tüm kelepçeleri ve kağıt bant katmanlarını çıkarın. Tarağı yavaşça çıkarın ve kuyuları damıtılmış suyla iyice durulayın.</li>
		<li>Jel sandviçi dikey jel elektroforez aparatına doğru şekilde yerleştirmek için ilgili tedarikçinin talimatlarını izleyin.</li>
		<li>Deiyonize suda TBE çalışma tamponunu (1x: 89 mM Tris-HCl, 89 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8) hazırlayın ve hem üst hem de alt rezervuarları tamponla doldurun.</li>
		<li>50 W'ta en az 30 dakika boyunca jel elektroforezinin ön çalışmasını gerçekleştirerek plakaları ısıtın.</li>
		<li>Ultra saf suda denatüre edici jel yükleme tamponu (DGLB: 1 M Tris-HCl, %80 formamid, %50 gliserol, %0.05 bromofenol mavisi) hazırlayın. NOT: GLB, oligonükleotid numunelerinin jel sistemine hareketinin izlenmesine yardımcı olur ve numunelerin jelin kuyucuklarına yüklenmesine izin verir. Denatüre edici ajan formamidin varlığı, DNA türlerinin denatüre olmayan bir PAGE'de bile boyutlarına göre ayrılmasına izin verir.</li>
		<li>Kurutulmuş numuneleri (adım 3.8'deki numuneler) 5 μL DGLB içinde yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Numuneleri yüklemeden önce, üreyi kuyulardan çıkarmak için küçük bir şırınga ve üst tampon odasındaki TBE tamponunu kullanarak kuyucukları temizleyin. NOT: Kuyuları doğru bir şekilde temizlemek için bu adımı birkaç kez tekrarlayın, böylece yorumlanması zor bantlardan kaçının.</li>
		<li>Numuneleri temiz kuyulara yükleyin ve yükleme sırasını not edin.</li>
		<li>Jel elektroforezini 50 W'ta 2 saat veya en azından bromofenol mavisi boya jelin 2/3'ünü akıtana kadar çalıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Jelin görüntülenmesi<ol><li>Elektroforezden sonra güç kaynağını kapatın, cam sandviçi çıkarın ve bardakları temizleyin.</li>
		<li>Bir jel görüntüleyici kullanarak tarayarak FAM etiketli oligonükleotid bantlarının floresansını tespit edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Kimyasal Haritalama Kullanarak Bir DNA Şablonundaki G-Dörtlülerini Tanımlama

<ol>
	<li>Davis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quartets+40+years+later:+from+5'-GMP+to+molecular+biology+and+supramolecular+chemistry.">G-quartets 40 years later: from 5'-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry.</a> Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).</li><li>Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+functions+of+DNA+and+RNA+G-quadruplexes.">The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).</li><li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome.">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).</li><li>Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+evaluation+of+a+bis-3-chloropiperidine+derivative+incorporating+an+anthraquinone+pharmacophore.">Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).</li><li>Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+containing+bridging+lysine+linkers:+Influence+of+side+chain+structure+on+DNA+alkylating+activity.">Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).</li><li>Zuravka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+DNA+cleavage+activity+of+bis-3-chloropiperidines+as+alkylating+agents.">Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents.</a> ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).</li><li>Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-CePs+as+cross-linking+probes+for+the+investigation+of+RNA+higher-order+structure.">B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure.</a> Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-3-chloropiperidines+targeting+TAR+RNA+as+a+novel+strategy+to+impair+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Molecules. 26 (7), 1874 (2021).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+bis-3-chloropiperidines+as+RNA+modulators+targeting+TAR+and+TAR-protein+interaction.">In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+and+topoisomerase+II+mediated+DNA+damage+by+bis-3-chloropiperidines:+The+importance+of+being+an+earnest+G.">Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G.</a> ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).</li><li>Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+single-stranded+DNA+molecules+that+bind+and+inhibit+human+thrombin.">Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin.</a> Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).</li><li>Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+single-stranded+DNA+aptamer-binding+site+of+human+thrombin.">The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behind+the+mirror:+chirality+tunes+the+reactivity+and+cytotoxicity+of+chloropiperidines+as+potential+anticancer+agents.">Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).</li><li>Carraro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appended+aromatic+moieties+in+flexible+bis-3-chloropiperidines+confer+tropism+against+pancreatic+cancer+cells.">Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells.</a> ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).</li><li>Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+dichroism+and+conformational+polymorphism+of+DNA.">Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).</li><li>Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+and+dimethyl+sulfate+footprinting+for+characterization+of+G-quadruplexes+and+G-quadruplex-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

G-dörtlüleri, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde katlanan nükleik asit ikincil yapılarıdır ve genetik kontrol ve hastalıklarla ilişkileri nedeniyle önemli araştırma hedefleridir. B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, fizyolojik tuz koşulları altında G-tetradların oluşumunda rol oynayan guanin bazlarını tanımlamak için kullanılabilen DNA G4'lerin karakterizasyonu için yararlı bir protokoldür.
Bu protokolde kullanılan kimyasal prob, guanin nükleob...

Tipik Watson-Crick çift sarmalına ek olarak, nükleik asitler, guanin açısından zengin dizileri nedeniyle alternatif G-dörtlü (G4) formu gibi çeşitli ikincil yapıları benimseyebilir. G4 yapısı, dört guaninin Hoogsteen hidrojen bağları yoluyla etkileşime girdiği G-tetradlar adı verilen düzlemsel tetramerlerin oluşumuna dayanır. G-tetradlar, guanin çekirdeğinin merkezinde koordine edilen monovalent katyonlarla istiflenir ve daha da stabilize edilir (Şekil 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg"> Şekil 1: G-dörtlü yapısının şematik gösterimi. (A) Bir G-tetradının şematik gösterimi. Düzlemsel dizi, Hoogsteen baz eşleşmesi ve merkezi bir katyon (M+) ile stabilize edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
En az iki ardışık guanin nükleotidinin dört veya daha fazla çalışmasına sahip diziler, G-dörtlü yapılarda katlanabilen potansiyel G-dörtlü oluşturan dizilerdir (PQS'ler). PQS'ler, telomerler, gen promotörleri, ribozomal DNA ve rekombinasyon bölgeleri gibi birçok farklı hücresel bağlamda bulunur ve birçok biyolojik sürecin düzenlenmesinde rol oynar2. Bu nedenle, şu anda esas olarak hesaplama araçları aracılığıyla gerçekleştirilen insan genomundaki G4'lerin tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması, biyolojik olarak ilgili bir konudur3. Hesaplamalı tahminleri desteklemek veya öngörülemeyen G4 yapılarını tespit etmek için, bir DNA şablonundaki G4 oluşumunu tanımlamak için kimyasal haritalamaya dayalı erişilebilir bir yöntem burada gösterilmektedir ve G-tetrad yapısını oluşturan guaninlerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar.
Rapor edilen kimyasal haritalama testi, G4 yapılarının oluşumunu takiben bis-3-kloropiperidinlerin (B-CeP'ler) guaninlerle farklı reaktivitesinden yararlanır. Nükleofiller 4,5,6,7,8,9 ile yüksek reaktiviteleri nedeniyle, B-CeP'ler, guanin nükleotidlerinin10 N7konumu ile çok verimli bir şekilde reaksiyona girme kabiliyetine sahip nükleik asit-alkilleyici ajanlardır. Alkilasyonu, tek ve çift sarmallı DNA yapılarında depurinasyon ve iplik bölünmesi takip eder. Aksine, G4 düzenlemelerinde G-tetradların oluşumunda yer alan guaninler, guaninlerin N7konumu Hoogsteen hidrojen bağlarında rol oynadığından, B-CeP alkilasyonuna karşı geçirimsizdir. B-CeP'lerin bu spesifik reaktivitesi, yalnızca G4 yapılarının saptanmasına değil, aynı zamanda tetrad(lar)ı oluşturan guaninlerin tanımlanmasına da izin verir, çünkü bunlar, tek ve çift sarmallı DNA'daki guaninlere kıyasla alkilasyondan göreceli korumalarından çıkarılabilir.
Kimyasal haritalama protokolü burada, potasyum katyonları 11,12 varlığında G4 düzenlemesini üstlenebilen bir 15-mer DNA olan trombin bağlayıcı aptamerin (TBA) karakterizasyonu için bir prob olarak B-CeP 1 (Şekil 2A) kullanılarak rapor edilmiştir. TBA'nın G4 düzenlemesi (G4-TBA), tek sarmallı formda TBA (ssTBA) ve çift sarmallı yapıyı (dsTBA) oluşturmak için tamamlayıcı dizisine tavlanmış TBA olmak üzere iki kontrol ile doğrudan karşılaştırılır (Tablo 1). Sondalama reaksiyonlarının ürünleri, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülür. Jel üzerinde görselleştirme, TBA oligonükleotidinin 3' ucunda bir florofor ile konjugasyonu ile sağlanır (Tablo 1). Bu protokol, TBA'nın farklı konformasyonlarında (G4 ve kontroller) nasıl katlanacağını ve B-CeP'ler ve ardından PAGE ile sondalama reaksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylamide/bis-acrylamide solution 40%</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3658</td>
			<td>R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 
			24/25-62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium per-sulfate (APS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>pbi international</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue Brilliant blue R</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligonucleotides</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>synthesis of custom sequences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>40248</td>
			<td>H351-360D-373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>GE Healtcare</td>
			<td>STORM B40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tubes 0.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing apparatus</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Model S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>85126</td>
			<td>H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>480086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speedvac concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Savant DNA 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>87689</td>
			<td>R11-21/22-23-34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>1.08387.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>51456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro chemical mapping of g-quadruplex dna structures by bis-3-chloropiperidines

G-dörtlüleri (G4'ler), gen ekspresyonu ve hastalıklarda önemli bir rol oynayan ve önemli terapötik hedefleri temsil eden, biyolojik olarak ilgili, kanonik olmayan DNA yapılarıdır. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler (PQS'ler) içinde DNA'nın in vitro karakterizasyonu için erişilebilir yöntemler gereklidir. B-CeP'ler, nükleik asitlerin yüksek dereceli yapısının araştırılması için yararlı kimyasal problar olduğu kanıtlanmış bir alkilleyici ajan sınıfıdır. Bu makale, guaninlerin N7'si ile B-CeP'lerin spesifik reaktivitesinden yararlanan yeni bir kimyasal haritalama testini ve ardından alkillenmiş Gs'de doğrudan iplik bölünmesini açıklamaktadır.
Yani, G4 kıvrımlarını katlanmamış DNA formlarından ayırt etmek için, G4 düzenlemesini üstlenebilen 15-mer'lik bir DNA olan trombin bağlayıcı aptameri (TBA) araştırmak için B-CeP 1'i kullanıyoruz. B-CeP'ye yanıt veren guaninlerin B-CeP 1 ile reaksiyonu, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülebilen ürünler verir. B-CeP'leri kullanarak haritalama, G-dörtlü oluşturan DNA dizilerinin in vitro karakterizasyonu için basit ve güçlü bir araçtır ve G-tetradların oluşumunda yer alan guaninlerin kesin konumunu sağlar.

In addition to the typical Watson-Crick double helix, nucleic acids can adopt various secondary structures, such as the alternative G-quadruplex (G4) form, due to their guanine-rich sequences. G4 structure is based on the formation of planar tetramers, called G-tetrads, in which four guanines interact through Hoogsteen hydrogen bonds. G-tetrads are stacked and further stabilized by monovalent cations that are coordinated in the center of the guanine core (Figure 1)1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65373/65373fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of a G-quadruplex structure. (A) Schematic representation of a G-tetrad. The planar array is stabilized by Hoogsteen base-pairing and by a central cation (M+).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65373/65373fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Sequences with four or more runs of at least two consecutive guanine nucleotides are potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs) that can fold in G-quadruplex structures. PQSs are located in many different cellular contexts, such as at telomeres, gene promoters, ribosomal DNA, and recombination sites, and are involved in the regulation of many biological processes2. Hence, the identification and experimental validation of G4s in the human genome, which is currently performed primarily through computational tools, is a biologically relevant issue3. In order to support computational predictions or detect unpredicted G4 structures, an accessible method based on chemical mapping to identify the G4 formation in a DNA template is shown here, enabling the precise identification of guanines forming the G-tetrad structure.
The reported chemical mapping assay exploits the different reactivity of bis-3-chloropiperidines (B-CePs) with guanines following the formation of G4 structures. Due to their high reactivity with nucleophiles4,5,6,7,8,9, B-CePs are nucleic acid-alkylating agents with the ability to react very efficiently with the N7 position of guanine nucleotides10. Alkylation is followed by depurination and strand cleavage in single- and double-stranded DNA constructs. On the contrary, guanines involved in the formation of the G-tetrads in G4 arrangements are impervious to B-CeP alkylation, as the N7 position of guanines is implicated in the Hoogsteen hydrogen bonds. This specific reactivity of B-CePs allows not only the detection of G4 structures, but also the identification of the guanines forming the tetrad(s), as they can be deduced from their relative protection from alkylation compared with guanines in single- and double-stranded DNA.
The chemical mapping protocol is reported here using B-CeP 1 (Figure 2A) as a probe for the characterization of thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement in the presence of potassium cations11,12. The G4 arrangement of TBA (G4-TBA) is directly compared with two controls, namely TBA in the single-stranded form (ssTBA) and TBA annealed to its complementary sequence to form the double-stranded construct (dsTBA) (Table 1). Products of probing reactions are resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at the single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Visualization on the gel is enabled by conjugation of the TBA oligonucleotide with a fluorophore at its 3&#39;-end (Table 1). This protocol shows how to fold TBA in its different conformations (G4 and controls), and how to perform probing reactions with B-CePs followed by PAGE.

Yazar Spot Işığı: Bis-3-Kloropiperidin Bazlı Kimyasal Haritalama ile DNA G-Quadruplex'in Karakterize Edilmesi 

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

G-quadruplex are nucleic acid secondary structures that typically formed within guanine-rich DNA sequences. The chemical mapping of G4 by B-CePs aims at the in vitro characterization of G4, and allows the identification of the specific guanines forming the G-tetrads. The identification and the experimental validation of G4s within potential G-quadruplex-forming sequences is a biologically relevant issue, which is currently addressed primary through computational tools.To support such predictions and detect the unpredicted G4, chemical mapping by B-CePs represents an accessible method to identify G4 in DNA sequences. The chemical mapping by B-CePs is a convenient alternative to the widely used dimethyl sulfate footprinting protocol for the characterization of G-quadruplex. The key advantage by B-CePs is that it reduces the number of steps in the protocol and it reduces the initial amount of the DNA substrate.The chemical mapping by B-CePs is described here with the TBA sequence as a proof of concept. The protocol will lead to new experiments applicable to any other potential G-quadruplex-forming sequence exploring both DNA and RNA constructs.

Şekil 2, üç farklı yapıda katlanmış TBA oligonükleotidi üzerinde B-CeP 1 ile protokolde açıklandığı gibi, gerçekleştirilen bir kimyasal haritalama testinin temsili bir sonucunu göstermektedir. TBA'nın G-dörtlü düzenlemesi (G4-TBA), oligonükleotidin BPE'de ve K+ katyon varlığında katlanmasıyla elde edilirken, aynı TBA dizisinin (ssTBA) tek sarmallı formu potasyum yokluğunda katlandı. Çift sarmallı yapı (dsTBA), TBA'nın BPE tamponundaki tamamlayıc?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing DNA G-Quadruplex by Bis-3-Chloropiperidine Based Chemical Mapping at JoVE.com

Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP'ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP'ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

G-dörtlüsü, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde oluşan nükleik asit ikincil yapılarıdır. G4'ün B-CeP'ler ile kimyasal haritalanması, G4'ün in vitro karakterizasyonunu amaçlar ve G-tetradlarını oluşturan spesifik guaninlerin tanımlanmasına izin verir. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler içinde G4'lerin tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması, şu anda birincil olarak hesaplama araçları aracılığıyla ele alınan biyolojik olarak ilgili bir konudur.Bu tür tahminleri desteklemek ve öngörülemeyen G4'ü tespit etmek için, B-CeP'ler ile kimyasal haritalama, DNA dizilerinde G4'ü tanımlamak için erişilebilir bir yöntemi temsil eder. B-CeP'lerin kimyasal haritalaması, G-dörtlüsünün karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan dimetil sülfat ayak izi protokolüne uygun bir alternatiftir. B-CeP'lerin en önemli avantajı, protokoldeki adım sayısını azaltması ve DNA substratının başlangıç miktarını azaltmasıdır.B-CeP'ler tarafından yapılan kimyasal haritalama, burada bir kavram kanıtı olarak TBA dizisi ile açıklanmaktadır. Protokol, hem DNA hem de RNA yapılarını araştıran diğer potansiyel G-dörtlü oluşum dizisine uygulanabilir yeni deneylere yol açacaktır.

in-vitro-chemical-mapping-g-quadruplex-dna-structures-bis-3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

863 Görüntüleme.  University of Padova. G-dörtlüsü, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde oluşan nükleik asit ikincil yapılarıdır. G4'ün B-CeP'ler ile kimyasal haritalanması, G4'ün in vitro karakterizasyonunu amaçlar ve G-tetradlarını oluşturan spesifik guaninlerin tanımlanmasına izin verir. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler içinde G4'lerin tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması, şu anda birincil olarak hesaplama araçları aracılığıyla ele alınan biyolojik olarak ilgi...

Video: Yazar Spot Işığı: Bis-3-Kloropiperidin Bazlı Kimyasal Haritalama ile DNA G-Quadruplex'in Karakterize Edilmesi 

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

Biyokimya

Folding and Probing of Nucleic Acid Constructs

Begin by pipetting G4-TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA solutions into three different tubes for folding. Heat the samples to 95 degrees Celsius for five minutes. Let them cool slowly to room temperature.Once the tubes have cooled to room temperature, centrifuge the tubes. Next, organize three sets each of seven empty autoclaved 0.5-milliliter tubes. Add three microliters of ultrapure water into each tube.Pipette five microliters of the folded nucleic acid constructs into each tube of the set. Next, add two microliters of either 25 or 250-micromolar B-CEP1 to obtain the final probe concentration of five and 50 micromolar respectively. To the three control tubes, add ultrapure water instead of the compound and incubate all the samples at 37 degrees Celsius.Stop the reaction by placing the tubes at 20 degrees Celsius, then dry the samples in a vacuum centrifuge.

Nükleik Asit Yapılarının Katlanması ve İncelenmesi

Separation of Polymerized Nucleic Acid Constructs by PAGE 

Begin by preparing a polymerized page gel sandwich. Remove the clamps and paper tape layers, and slowly remove the comb. Thoroughly rinse the wells with distilled water.Place the gel sandwich correctly in the vertical electrophoresis apparatus. Fill the top and bottom reservoirs with TBE buffer. Warm up the plates by performing a pre-run of the gel electrophoresis for at least 30 minutes at 50 watts.Meanwhile, re-suspend the dried samples in five microliters of denaturing gel loading buffer. Next, use a small syringe filled with TBE buffer to flush the urea out of the wells of the gel. Now load the samples into the clean wells, taking note of the odor of loading.Run the gel for two hours at 50 watts or until the bromophenol blue dye has run down 2/3 of the gel. After electrophoresis, turn off the power supply, carefully remove the glass sandwich, and clean the glass plates. Place the gel in a gel imager to detect the fluorescence of the FAM-labeled oligonucleotide bands.After one, four, and 15 hours of incubation, either five or 50 Micromolar Bsep 1 reacted with two micromolar samples of G4 TBA, single-stranded TBA, and double-stranded TBA. Controls were loaded for each set of samples. The G4 TBA substrate showed only one alkylation adduct due to the availability of only G8 for alkylation and subsequent stranded cleavage.Multiple adducts and bands of cleavage products were observed in single and double-stranded TBA, because all guanines were susceptible to Bsep reaction. Probing reaction and tris buffer resulted in inefficient chemical mapping due to the presence of undesired nucleophiles, causing reduced proprioactivity. The G4 TBA samples showed only the formation of adduct without stranded cleavage.For the single and double-stranded TBA, only a 24-hour incubation led to DNA fragmentation, comparable to the 15-hour fragmentation without Tris.