Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı IOS 0844948 ve 1024811 IOS tarafından desteklenen

Pratik olduğu kadar 15 ° C&#39;de tüm deniz suyu veya yapay deniz suyu (GB), yetişkin hayvanların ve kültürleri tutun. Emin olun yumurta ve zigot SW dalmış tutulur. Damıtılmış veya ters ozmoz su ile yeniden sahip ticari olarak hazırlanmış deniz tuzu SW kaynağı olarak da hizmet eder. Hidrometre kullanarak tuzluluk kontrol ve optimum düzeyde sağlamak için tuzlar veya su ayarlayın. 1,020-1,025 arasında özgül ağırlık düzeyleri tutun. Tüm cam tutun ve plasticware kimyasallar ile herhangi bir kirlenmeyi önlemek için diğer tüm laboratuvar donatımı ayrı. Deiyonize su ya da su içinde birkaç kez çalkalayın seyreltik sodyum hipoklorür ve zaman zaman ıslatma ile durulanarak temiz embriyo laboratuvar dereceli. Patiria miniata Yetişkinler 1. alınması ve olgunlaştırılması Gametler <ol><li> Gonadları çıkarılması için bir hayvan seçin. Yumurtalıkların veya testislerin varlığı bakarak çıkarıldıktan sonra seks belirleyin P. çünkü miniata se değildirxually dimorfik. </li><li> Bir bisturi (Şekil 1A) ile deniz yıldız kolun tarafındaki 1 cm&#39;den daha büyük, küçük bir açıklık, kesin. Küçük künt uçlu forseps geri kesi kenarları çekin kullanma gonad dokusu erişmek ve kesiden yumurtalık dokusu çekin. NOT: gevşek gri veya kahverengi doku (Şekil 1B) olduğu gut doku, çekerek kaçının. Testisler beyaz veya bej iken ve görünüm (Şekil 1D) sütlü veya puslanacak deniz suyu neden olacaktır bozulduğunda yumurtalıklar, tipik, turuncu, sarı veya açık kahverengi (Şekil 1C) vardır. </li><li> Akvaryuma kadın dönün. Yumurtlama neden olabilir işlenmesinin stres yana SW bir kap içinde bir veya iki saat için erkek izole. Hayvanlar kesi boyunca iyileşmek ve birkaç ay için gametler sağlamaya devam. </li><li> Mümkün olduğu kadar az SW, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içine testisler toplayın ve kullanılana kadar buz üzerinde muhafaza edin. Bize herhangi testisler değil Mağazabir haftaya kadar 4 ° C &#39;de toplama gününde ed. </li><li> SW birkaç mililitre küçük bir cam kültürü çanak yumurtalıklar toplayın. Hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar forseps iki çift dokuyu ayrı kızdırmak, yumurtalık dokusundan oosit bırakın. Not: En uygun olarak, oosit kısmı tam olarak geliştirilmiştir. Böyle oosit (Şekil 2B), kahverengi, küçük grenli ve opak olan gelişmemiş oosit alt kümesi karşılaştırıldığında, büyük yuvarlak ve oosit (Şekil 2A) belirgin bir torbacığı sarı veya açık kahverengi açıktır. Oositlerin daha yaklaşık 25% &#39;den fazla gelişmemiş çeşitten ise, oositlerin elde edilmesi için farklı bir kadın seçin. </li><li> 200 um bir gözenek boyutuna sahip olan bir gözenekli filtre kap aracılığıyla oosit ve kalan doku dökün ve akışı toplamak. Bu oosit tüm çeşitleri içeren ancak yumurtalık dokusu kaldıracaktır. W püskürtme ile filtre tarafından yakalanan dokudan kalan oosit bağdakibücür şişe ith GB. Filtre bardak 50 ml konik tüp (Şekil 3A-A &quot;) kullanılarak yapılır. </li><li> 100 mikron gözenekli filtre kap aracılığıyla adım 1.6 den yoluyla akışını dökün. Akmakta olan küçük oosit atın. Filtre üzerinde kalacak olgunlaşması için hazır büyük tam gelişmiş oosit. Temiz bir 200 ml&#39;lik bir cam kaba oosit durulayın. </li><li> Oosit 200 ml&#39;lik bir cam kabın SW 95 ml ilave edilir. 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyon 200 uM 1-metiladenin 5 ml. </li><li> 15 ° C&#39;de büyük bir sığ kültür çanak ve yere oosit aktarın. Hacim kültür tabağına bir yüksek yüzey alanlı oksijen alışverişine izin verir. Oosit olgun değil ya da bu olgunlaşma aşamasında kalabalık ise iyi gelişmemiş olabilir. Kültür az 200 oosit / ml kadar birkaç GB yemekler artı 10 uM 1-methlyadenine ayrıldı. </li><li> F oosit bu olamayacağım oosit kılacak gibi artık 45-90 dakika boyunca olgun, ama izin verertilized. Olgunlaşma tam olup olmadığını belirlemek için, bir diseksiyon kapsamında oosit bakmak. Olgunlaşma sırasında hücre zarı ile Germinal vezikül doğru hareket eder ve sigortalar. Daha sonra bozulur ve bu nedenle artık olgun oosit (Şekil 2C) görülebilir. </li></ol> Olgun OOSİT 2. Döllenme <ol><li> GB yaklaşık olarak 1 ml kültür, küçük bir cam tabak içinde testis dokusunda, yaklaşık bezelye boy, kıyma küçük bir küme seçti. </li><li> Olgun oositlerin yaklaşık 100 ml elde edilen süt, deniz suyunun 2-3 damla transferi ve karıştırmak için kültür kaplarına girdap Pasteur pipet kullanın. Testis doku parçalarını transfer kaçının. Polyspermy ve sonraki zayıf gelişmesine neden olabileceğinden spermlerin daha büyük miktarlarda ekleyerek kaçının. </li><li> Birkaç dakika sonra, bir diseksiyon kapsamında oosit gözlemlemek. Döllenmiş yumurta veya zigot, cel kapalı yükselir net bir kabarcık bir gübreleme zarf varl membran (Şekil 2B). NOT: kötü fertilizasyon oranları da iyi gelişmemiş olabilir sağlıksız bir kültürün bir göstergesi olduğundan yumurta az 90 civarında daha% döller eğer kültürü ile devam etmeyin. </li><li> Döllenme işlemi tamamlandıktan sonra, 100 mikron gözenekli filtre içinden dökülmesi ve taze yazılımı ile bir kültür kabı içine durulanarak zigot üzerinde verilmeksizin değiştirilebilir. Bu oksijen açlığı önlemek için fazla sperm kaldırmak için önemlidir. 15-30 dakika boyunca 15 ° C &#39;de kültür tabağına yerleştirin. </li></ol> 3. De-jelleştirici ve Kürek döllenmiş yumurta <ol><li> 60 x 15 mm polistiren Petri kabı kapağı alarak enjeksiyon yemekleri hazırlayın. <ol><li> Mikroenjeksiyon mikroskop görüş alanını eşleşen alanı çevresinde yemeğin arkasında, üzerinde kalıcı bir işaretleyici kalem çizgi çizin. Bu, tüm embriyolar sıralı görüş alanı içinde mikroskop olmasını sağlar. </li><li> Daire, p bir çizgi puanı bir cam Pasteur pipet kullanınreferably daire (Şekil 3B) bir tarafında kapalı. Enjeksiyon iğneleri (4.5 Adım) kırmak için daha sonra bu hattı kullanın. Not: Reaktifler genellikle deniz kestanesi embriyolar, örneğin, protamin sülfat ya da poli-L Lisin, gereksiz yapıştırmak için kullanılan. P. De-jöleli miniata zigot kaplanmamış plastiğe çok iyi sopa. Onlar cam yemekler iyi sopa unutmayın. </li></ol></li><li> Kaplanacak yüzey olması ve böylece her bir çanak yaklaşık 10 mi GB ekleyin, ancak bu embriyolar bozmakta sıralı olabilir su çanak aşırı sıçrama olmaz. </li><li> P. çıkarın önce kürek çekme asit SW ile miniata zigot jöle ceket. Bu jöle ceket modeli deniz kestanesi türleri için gözlenen daha kapsamlıdır. <ol><li> PH 4,0-4,2 aralığında asit SW hazırlayın. PH değeri, normal gelişim izin verecek şekilde jel kaplamanın etkin şekilde çıkarılmasını sağlamak için çok önemlidir. </li><li> GB 1 L&#39;lik bir stok SW içinde 1 N (1 M) tek HCI damla ekleyin. Her damla tamamen karıştırmak için izin verve daha HCI ilave edilmeden önce pH izlemek. NOT: Uygun pH HCl sonuçlarının birçok ml biri, ancak bir kerede tüm hacmi eklemeyin. NOT: SW ile davlumbaz 1 N HCI hazırlayın ve 12 N (12 M) HCI. </li><li> 100 mikron gözenekli filtre üzerine onları dökerek zigot üzerinde SW çıkarın. (Yaklaşık 10 mi) mümkün olan en küçük SW miktarda bir 200 ml&#39;lik bir cam kaba durulayın. Asit SW (pH 4,0) ile 150 ml beher kadar doldurun ve zigot 3 dakika boyunca asit SW oturmak için izin. </li></ol></li><li> Iki adet 200 ml&#39;lik çanaklar arasında ileri ve geri onları dökerek zigotlardan jöle ceket şerit, 200 mikron mesh filtre üzerinden zigotların geçen her zaman. Bir 2 dakikalık bir zaman penceresi üzerinde 5-10x çevresinde filtre içinden zigotların dökün. </li><li> 100 mikron gözenekli filtre üzerine zigotların dökerek asit SW çıkarın. SW ile küçük bir cam kültürü çanak içine zigotların durulayın. De-jöleli zigot plastik tabaklar yapışabilir. Satır embriyolar derhal; daha j üretmeye başlarzamanla plastik tabaklar zayıf yapışmasına yol açar kedward ceket. </li><li> Cam kültürü çanak zigotların pick up ve enjeksiyon yemekleri düz çizgiler içine yerleştirmek için bir ağız pipet (Şekil 3C-C &#39;) kullanın. Cam, yumuşak kadar bir alev üzerinde bir Pasteur pipeti ince yan merkezini eritin. Hızlı bir cam çok ince esneme elde etmek için ayrı cam uçlarını çekin. Cam soğuduktan sonra, (bir ağız pipet Wessel ve arkadaşları görmek hazırlama hakkında ek bilgi için., 2004 17 Sweet ark. 2004 18) Pasteur pipet küçük ucunu kesiyorum. <ol><li> Sadece tek bir zigot girerek bir seferde pipet çıkış böylece çapı, embriyoların çapından biraz daha büyük olan bir kürek pipet hale getirmektedir. Bu, tek bir sıra oluşturacak şekilde izin verir. Küçük çaplı pipetler döllenme zarfı şerit ve P. gibi zigotların bozabilir miniata zigot hiyalin membran a yoknd oldukça yumuşak. </li><li> Zigot plastik tabak sopa yoksa, ek süre asit SW (birkaç dakika daha kadar) için saklayın. Alternatif olarak, daha küçük çaplı bir pipet zigotlar daha etkili bir şekilde yapışmasına izin vermek için jöle katı çıkartılmadan yardımcı olabilir. </li><li> Zigot biraz olumlu batmaz ve yüzer ya da sadece yemeğin alt yukarıda hover eğiliminde. Zigotlar nazik bir pipet (Şekil 3D) çıkar çıkmaz, çanak yüzeyine bastırılır, böylece bu durumda kürek pipet yerleştirin. NOT:. Bu yemekler birçok satır sığdırmak için izin olan P. miniata embriyonik membranlar zamanla nüfuz daha zor hale gelmez ve bu nedenle tek bir tek tabak üzerinde zigot yüzlerce enjekte edebilir. </li></ol></li></ol> Zigotlar 4. Enjeksiyon <ol><li> Final konsantrasyona uygun morfolino antisens oligonükleotitlerin konsantrasyonları (MASO), mRNA ya da enjeksiyon çözeltileri DNA&#39;lar ile hazırlayın200 mM KCl entration. 400-800 uM MASO ve DNA, 2.5 ng / ml toksisiteyi en aza indirirken, morphant fenotipleri üretme eğilimindedir. Yumurta nihai konsantrasyonu, bir başlangıç ​​konsantrasyon 14. 1/125 olur. 5 dakika boyunca 65 ° C&#39;ye kadar Masos ısı ihtiva eden enjeksiyon çözeltileri için kullanımı ve daha sonra oda sıcaklığında saklamak için hemen önce. <ol><li> Enjekte edilen embriyolar sıralama kolaylığı için,% 0.1 lik bir konsantrasyon elde etmek için enjeksiyon solüsyonu için rodamin dekstran izleyici ekleyin. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre çekme aracı, bir iğne cam kılcal boru (1,0 mm dış çaplı x 0.75 mm İÇ, 100 mm uzunluk) çekerek enjektör hazırlayın. Deniz kestanesi enjeksiyon için uygun iğneler de deniz yıldızları için iyi çalışabilir, böylece benzer parametreleri 19 kullanın. </li><li> Bir Microloader pipet kullanarak bir enjeksiyon iğnesi içine enjeksiyon solüsyonu yaklaşık 2 ul yükleyin. </li><li> M içine iğnenin künt ucunuanipulator. Set 100 milisaniye darbesine Picospritzer ve 40 psi hava basıncı. </li><li> Mikroskop sahneye sıralı embriyoların bir tabak koyun ve görüş alanındaki tüm embriyolar var. Atılan hattı iğneye yakın tarafında olacak şekilde çanak yönlendirilir. Uç hattının ortasına yakın ve sadece su yüzeyinin üstünde olacak şekilde yaklaşık 60 ° &#39;lik açı iğne yerleştirin. </li><li> Atılan hat odaklanın ve ucu odak noktası haline gelene kadar iğne düşük. Biraz daha ipucu indirin ve attı hattının sırtlar içine hafifçe çalıştırarak açık ara. Çanak yüzeyinden ucu kaldırın ve zigot ilk satırının üstünde konumlandırmak ve zigot odaklanmak. </li><li> Bir 60 ° bir açıda gelen zigotun merkezi impale sağlayacak şekilde ucu aşağı indirin. İğne kolayca P. nüfuz miniata zigot. Enjeksiyonundan bir bolus tanıtmak için ayak pedalı (veya enjeksiyon iğnesi malzeme zorlayarak diğer araçlarla) adımembriyo ölü m çözeltisi. </li><li> % 20-30 embriyo çapı ya da 25 ile 80 pl bir bolus nişan. Bolus bundan daha büyük veya daha küçük ise, Picospritzer üzerinde enjeksiyon süresini ayarlamak ve sonraki embriyo enjekte edilir. İstenen bolus boyutu elde etmek süresini ayarlamak için devam edin. 100 msn süresince başlayın. Yaklaşık 200 milisaniye daha büyük uygun hapını tanıtmak gerekirse iğne Yeniden bölünürler. İğneyi atın ve en az 15-20 msn iğne boyutu çok büyük olduğu gibi bu hap boyutu elde etmek için gerekli ve normal gelişimini bozabilir, yeni bir tane hazırlayabilirsiniz. </li><li> Enjeksiyon yemeğin kalan zigotların enjekte edin. Embriyolar kolayca bölünme başlayana kadar ve ilk bölünmesinden sonra tek blastomer içine enjekte edilebilir. Periyodik olarak, iğne yapışmazlar, zigotların kaldırmak için su yüzeyinin üzerinde iğne kaldırın. Gerekli iğne ucu yeniden kırmak ya da bir tıkanma meydana gelirse yeni bir iğne yüklerseniz. </li></ol><ol><li> Embriyolar SW 15 ° C&#39;de geliştirmeye olanak sağlar. Oksijen alış verişine olanak sağlamak için, kültürler içinde hacme büyük bir yüzey alanına koruyun. Embriyolar kalabalık değil emin olun; veya 200 embriyolar / ml altında kültürleri tutun. Embriyonun istenilen aşamaya bağlı olarak, yaklaşık 20-24 saat sonrası döllenme enjekte embriyolar toplamak planlıyoruz. NOT: Bu genellikle sıralamak ve normal gelişen embriyo kolayca morfolojik ayırt edilir, ancak henüz yüzme olmadığından toplamak ve ideal bir zamandır. </li><li> Embriyolar yumurtadan varsa, yavaşça yüzme önlemek için şok tuz. SW yavaşça girdap şeklinde sallandı enjeksiyon çanak GB 10 ml 5 M NaCI 200 ul ilave edin. Bir kaç dakika sonra, embriyolar yemeğin altına düşecek. Bu toplayın ve normal tuzluluk SW taşıyabilirsiniz. </li><li> Injecti kullanılan izleyici ile uyumlu uygun bir floresan ışık kaynağının altında enjekte embriyolar toplayınçözüm üzerinde. Hiçbir izleyici kullanılmışsa, sıralama embriyolar normal morfolojiye seçmek için. </li><li> Ağız pipet kullanarak, SW asgari bir miktarı ile embriyolar floresanlama çekmek ve SW ile dolu küçük bir kültür çanak içine üfle. İdeal ağız pipetler embriyolar onlara zarar vermeden ve dışarı çıkardı, ama istenmeyen embriyolar ve yabancı GB da yukarı çekti, böylece büyük olmamak için yeterince büyük bir açılış var. </li><li> Bir kez istenen tüm embriyoların yeni bir çanak içine toplanmıştır, floresan ışığı altında embriyoların gözlemlemek ve herhangi bir un-enjekte edilen embriyolar veya az gelişmiş embriyolar kaldırmak. </li><li> Kültür bir kuluçka istenen aşamalarında embriyolar sıralanır ve görüntüleme veya diğer istenen protokolleri ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+fluorescence+in+thick+specimens,+with+an+application+to+cyclin+B-GFP+expression+in+starfish+oocytes.">Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes.</a> Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).</li><li>Terasaki, M., Runft, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+dependence+for+1-methyladenine+induced+reinitiation+of+meiotic+maturation+in+starfish+oocytes.">Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes.</a> Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).</li><li>O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+multiple+Src+family+kinases+at+fertilization.">Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization.</a> J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).</li><li>McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+wnt+and+frizzled+genes+during+early+sea+star+development.">Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development.</a> Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).</li><li>Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+network+for+neurogenesis+in+a+sea+star+embryo+connects+broad+neural+specification+and+localized+patterning.">Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).</li><li>McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+embryonic+skeletogenic+mesenchyme+lineage+in+a+sea+cucumber+reveals+the+trajectory+of+change+for+the+evolution+of+novel+structures+in+echinoderms.">Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms.</a> EvoDevo. 3, 17 (2012).</li><li>Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+cluster+and+chordate-like+expression+of+ParaHox+genes+in+a+sea+star.">Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star.</a> BMC Biol. 11, 68 (2013).</li><li>Morino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+activation+of+VEGF+signaling+and+the+evolution+of+the+skeleton+in+echinoderm+pluteus+larvae.">Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae.</a> Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).</li><li>Hart, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+evolution+of+the+sea+star+egg+receptor+for+sperm+bindin.">Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin.</a> Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).</li><li>McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergence+genetics+analysis+reveals+historical+population+genetic+processes+leading+to+contrasting+phylogeographic+patterns+in+co-distributed+species.">Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species.</a> Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).</li><li>Keever, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discordant+distribution+of+populations+and+genetic+variation+in+a+sea+star+with+high+dispersal+potential.">Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential.</a> Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).</li><li>Lambert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).</li><li>Dor&#233;e, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+control+of+meiosis:+specificity+of+the+1-methyladenine+receptors+in+starfish+oocytes.">Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+gene+regulatory+network+architecture+across+500+million+years+of+echinoderm+evolution.">Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).</li><li>Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+evolutionary+act:+precise+cis-regulatory+basis+of+difference+in+the+organization+of+gene+networks+of+sea+stars+and+sea+urchins.">Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins.</a> Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).</li><li>McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+gene+regulatory+network+subcircuit+drives+different+developmental+fates+in+the+vegetal+pole+of+highly+divergent+echinoderm+embryos.">A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos.</a> Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).</li><li>Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+and+handling+echinoderm+oocytes.">Obtaining and handling echinoderm oocytes.</a> Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).</li><li>Sweet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomere+isolation+and+transplantation.">Blastomere isolation and transplantation.</a> Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).</li><li>Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+microinjection+of+fertilized+eggs.">Rapid microinjection of fertilized eggs.</a> Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).</li><li>Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantropic+retroviruses+as+a+transduction+tool+for+sea+urchin+embryos.">Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).</li></ol>

Çıkar çatışması yazarlar tarafından ilan edilmiştir.

Bu tekniğin acemi kullanıcılar için zor ama başarıyla morphant embriyolar oluşturmak için gerekli olan iki kritik adımlar vardır. İlk olgun ve düzgün döller sağlıklı oosit seçmektir. Bir kültürde normal gelişim yüzdesi mevsime göre, hayvanın sağlığını ve oositler tek bir bireysel, hasat edilen sayısıdır. Oositler Ekim ile Nisan arasında daha kaliteli olma eğilimindedir. Bu çoğunluk Şekil 2A yerine Şekil 2B gibi bakmak emin geçmeden önce oosit dikk...

(Yaygın yarasa yıldızı olarak da bilinir), deniz yıldızı, Patiria miniata, bir 6 8 evrimsel 4,5 gelişim hücresel 1- 3 çeşitli, ve ekolojik çalışmalar 9 11 için ilginç ve çok yönlü bir model sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Yetişkin P. miniata Baja California 12 Sitka, Alaska pasifik kıyılarında dağıtılır ve kolayca deniz akvaryumunda tutulur. Oositler elde yıl boyunca ve her kadın onlarca yumurta binlerce tutabilir. Oositler kolayca olgunlaştı ve dıştan 13 döllenir. Oluşan embriyolar kolay gözlem için izin şeffaf; onlar eşzamanlı geliştirmek ve geliştirme için sadece deniz suyu gerektirir. Tüm genom düzeneği ve çok sayıda transcriptomes, P. mevcuttur miniata ( <a href="http://www.echinobase.org/Echinobase/">Echinobase.org</a> ). Bu avantajlar araştırma aralığı için ideal hale getirmektedirve öğretim amaçları. Son yıllarda, S. miniata gelişim düzenleyici gen şebekesi için bir model sistem 14-16 analiz haline gelmiştir. Bu tür çalışmaların amacı, düzenleyici genlerin tüm iltifat belirlemek ve bunların etkileşimlerinin ağı belirlemektir. Bu çalışmaların çoğu antisens oligonükleotidlerinin ya da in vitro sentezlenen mRNA ile tanıtım yoluyla perturbe gen ifadesini gerektirir. Buna ek olarak, sis düzenleyici analizler düzenleyici DNA 15 işlevini karakterize etmek için kullanılır. Bu analizler karışıklık reaktifler ve / veya DNA muhabiri embriyolara inşa tanıtılması gerektirir. Ayrıca, bu düzensizliklerin bir aşağı akış etkisine karakterize etmek için, bir potansiyel hedefler, gen ekspresyonunda değişmeler için çok sayıda embriyolar tahlil gerekir. Zigot yüzlerce mikroenjeksiyon teknikleri bu işin merkezindedir. P. dahil derisidikenliler miniata </em&gt;, cinsel olgunluğa ulaşmak için birçok ay gerektirir. Bu nedenle, geliştirilmesi ve bu deneysel hayvan transgenik çizgiler korumak için genel olarak pratik değildir. Bu nedenle, transgenik yetişkinlerin üreme verimli embriyolar modifiye oluşturabilirsiniz olamaz. Bunun yerine, pertürbasyon mikroenjeksiyon yoluyla de novo gerçekleşmesi gerekir. Mikroenjeksiyon hücre geçirgen olmayan reaktif ile embriyolar değiştirmek için bir fırsat sunuyor. Aşağıdaki protokol, bir 2-3 saat mikroenjeksiyon yoluyla oturma döllenmiş yumurta yüzlerce DNA, mRNA, hücre izleyiciler ve morfolino antisens oligonükleotitlerin bir yöntemi tarif etmektedir. Bu gibi akış aşağı deneyler çeşitli için yeterli malzeme oluşturur, ancak in situ hibridizasyon, RNA sekansına ve Western blot ile, QPCR ancak bunlarla sınırlı değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1-Methyladenine</td>
			<td style="width:147px;">Acros Organics (Fisher Scientific)</td>
			<td style="width:119px;">AC20131-1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">190 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0185-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">100 micron nitex nylon filter</td>
			<td style="width:147px;">Small Parts (originally Sefar)</td>
			<td style="width:119px;">CMN-0105-C/5PK-05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Capillary tubing</td>
			<td style="width:147px;">FHC, Inc</td>
			<td style="width:119px;">30-30-0</td>
			<td style="width:167px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Model P-97 Needle Puller</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:216px;">Dextran, Rhodamine Green</td>
			<td style="width:147px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7163</td>
			<td style="width:167px;">If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td style="width:147px;">Doctors Foster and Smith</td>
			<td style="width:119px;">CD-116528</td>
			<td style="width:167px;">Also available in many pet stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5242 956.003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for microinjection of patiria minata zygotes

Echinoderms uzun gen düzenlemesi ve gelişimsel süreçlerinin evrim çalışma için daha yakın üreme ve gelişme çalışmaları için bir favori model sistem olmuştur ve. Deniz yıldızı Patiria miniata önce deniz kestanesi, Strongylocentrotus purpuratus ve Lytechinus variegatus hemen hemen sadece çalışmalar yapılmıştır Bu tip bir model sistem olarak yaygınlık kazanmaktadır. Bu model sistemler bir avantajı da, belirli bir genin veya aşağı regüle kadar olan bir grup hücre etiketleme ya da bir raportör genin modifiye edilmiş embriyoların üretilmesi kolaylığıdır. Tek bir yöntem, modifiye edilmiş mikro-enjeksiyon embriyo çeşitli oluşturma yeteneğine sahiptir. Burada, P. gamet elde edilmesi için bir yöntem sunulmaktadır miniata, zigot üreten ve mikroenjeksiyon yoluyla perturbe maddeleri eklemek. Sağlıklı morphant embriyolar bundan sonra ge nicel ve nitel çalışmalar için izole edilmiştirne fonksiyonu. Bu organizma için genomu ve transkriptom verilerin mevcudiyeti uygulandı ve gerçekleştirilmesinden kolaylığı olan çalışmalar türlerini artmıştır.

Bu protokolün amacı, embriyo içine reaktifler tanıtmaktır. Bu, yeşil floresan proteini (GFP) ekspresyonunu tahrik eden bir raportör konstruktunu bir DNA enjekte edilerek protokol etkinliğini göstermektedir. DNA bölünmesi sırasında ilk olarak birleştiren Enjekte embriyolar klonal yamalar (Şekil 4A-B) GFP ifade eder. Embriyoların içine uygulanması tercih edilmekte olan birçok reaktif maddeler, yüksek miktarlarda ve embriyo optimal gruplar için toksiktir. , Gelişimini geciktirmek döl...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes at JoVE.com

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zigotların

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

a-method-for-microinjection-of-patiria-minata-zygotes

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

10.9K Görüntüleme.  Carnegie Mellon University.  Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz. 

Video: A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biyoloji

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Chick Tüm Dağı Antikor Boyama Yöntemi

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Rotorod Rat Yürüyüş Kalitatif Analiz için bir yöntem olarak kullanımı

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Mikroenjeksiyon tarafından Memeli Hücreleri mRNA Nükleer İhracat Kinetik Analizi

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Akış Sitometri tabanlı Arıtma<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigot

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler