Name: live cell imaging of chromosome segregation during mitosis
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
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Wir möchten Dr. Guo-Chiuan Hung und Dr. Bharatkumar Joshi für wertvolle Kommentare bedanken, die das Manuskript verbessert.

Alle Experimente, die in diesen Studien wurden gemäß Protokollen durch die institutionelle Animal Care and Use Committee bei der Food and Drug Administration (FDA) Forschungseinrichtung genehmigt durchgeführt.
1. Isolierung und Kultur der Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs)
<ol><li>Isolieren Sie Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) aus einem PP2A-B56γ-Maus-Stamm und Wildtyp Wurfgeschwistern, indem Sie standard-Protokoll 7,8,9.</li>
	<li>ExpandMEFs für 3 Durchgänge, Einfrieren und lagern bis für Experimente 8benötigt.</li>
</ol>2. Kultivierung Mefs in 2-Well gekammerten Deckglas für Live-Imaging
<ol><li>Bereiten Sie 500 mL MEF Wachstumsmedien Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM/F12) mit 10 % mit fetalen Bovine Serum (FBS), 1 X Penicillin/Streptomycin Antibiotika, L-Glutamin (200 mM) und 1 X nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) in einen 500-mL-Medien-Flasche.</li>
	<li>Tauen Sie Fläschchen mit gefrorenen MEFs vom Wildtyp und PP2A-B56γ-Mäuse in der Passage 3 in vorgewärmten Wasserbad bei 37 ° C.</li>
	<li>Transfer MEFs, 15-mL-Röhrchen aufgetaut und die 15-mL-Röhrchen mit einer 10 mL-Pipette langsam tropfenweise 20 mL DMEM/F12 Medien hinzufügen.</li>
	<li>Übertragen Sie MEFs zusammen mit 20 mL DMEM/F12 Wachstumsmedien in T75 Kolben, und erweitern Sie sie, bis die Zellen 70 % Zusammenfluss sind. Konfluenz dürfte mit einem inversen Mikroskop bei 4 X oder 10 X Vergrößerung.</li>
	<li>Aspirat das Wachstumsmedium mit einer Glas-Weide pipette ein Vakuum-System in der Haube befestigt, 3 mL 0,25 % Trypsin/EDTA und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Add 3 mL DMEM/F12 Wachstumsmedium, die Reaktion zu stoppen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen mit geringer Geschwindigkeit (300 X g) für 5 min bei Raumtemperatur. Nehmen Sie des Überstands vorsichtig und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL DMEM/F12 Nährmedium bei 37 ° C in einem Wasserbad vorgewärmt.</li>
	<li>Auflisten von Zellen unter Verwendung der Trypan blau Ausschluss-Methode oder anderen entsprechenden Zelle zählen Methode 8.</li>
	<li>Etwa 20.000 Samen MEFs/Brunnen in einer 2-gut gekammerten Deckglas. Fügen Sie 200 µL/Well DMEM/F12 Wachstumsmedium und lassen Sie die Zellen durch brüten sie über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2befestigen.</li>
</ol>3. Synchronisation
<ol><li>Synchronisieren von MEFs in G0/G1-Phase durch Inkubation der Zellen in DMEM/F12 Wachstumsmedien mit 0,1 % FBS für 24 h, um eine maximale Anzahl von Zellen in der G0/G1-Phase zu erhalten. Hinweis: Obwohl Serum Hunger als Methode des Geschmacks verwendet wurde, können verschiedene andere Methoden je nach der mitotischen Phase verwendet werden bei denen Zellen erforderlich sind, um verhaftet 10sein.</li>
</ol>4. Kennzeichnung
<ol><li>Bereiten Sie 1,5 mg/mL Stammlösung von Nocodazole in DMSO. Nocodazole Festnahmen durch Hemmung der Mikrotubuli Bildung 10Zellen in G2/M-Phase.</li>
	<li>Drei Tage nach Synchronisation, fügen Sie 200 µL Wachstumsmedium (mit 10 % FCS), 200 ng/mL Nocodazole und CL-HB Regent (Histon 2 b-GFP BacMam 2.0).</li>
	<li>Berechnen Sie die CL-HB-Regent Partikel pro Zelle (PPC) Zellen wie folgt hinzugefügt werden: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq1.jpg"> Wo die Anzahl der Zellen die geschätzte Gesamtzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Kennzeichnung ist, PPC ist die Anzahl der Teilchen pro Zelle, und 1 × 108 ist die Anzahl der Teilchen pro mL Reagenz. Z. B. auf Label 20.000 Zellen mit einem PPC 30 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57389/57389eq2.jpg"> Hinweis: CL-HB Regent funktioniert gut mit den meisten Zelltypen zwischen 10 und 50 PPC. Allerdings funktionierte 30 PPC am besten für diese Studie.</li>
	<li>18 h bei 37 ° C und 5 % CO2MEFs inkubieren. Hinweis: Für das aktuelle Experiment trat Visualisierung von Chromosomen in mitotischen Zellen, die Flucht des Spindel Baugruppe Prüfpunkt 18 h nach Zellzyklus Festnahme mit Nocodazole.</li>
</ol>(5) Visualisierung rückständiger Chromosomen
<ol><li>Visualisieren Sie Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit einem drehenden Scheibe confocal Mikroskopsystem eine Klimakammer mit einem Ölimmersion, 63 X Objektiv ausgestattet.<ol>
<li>Verwenden Sie Erregung Wellenlänge von 488 nm und Emission Wellenlänge 450 nm für die GFP Kanal Bildaufnahme.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Datenträgersystem confocal Mikroskop Spinnen mit der Fähigkeit der motorisierten Scan Stufen, Z-Piezo einfügt, Bühne-Top Inkubation und direkte Fluoreszenz Erholung nach dem Foto bleichen für diese Technik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einen Tag vor Bildgebung, schalten Sie die Klimakammer macht und über Nacht die ganze Kammer bei 37 ° C erwärmen.</li>
	<li>Schalten Sie Strom für Mikroskopstativ, Kamera, Spinning Disk Unit, Beleuchter, Argonlaser, Computer und motorisierte Bühne.</li>
	<li>Lassen Sie das System 3 min. warmlaufen; Starten Sie den Argonlaser durch Drehen am Zündschlüssel. Schalten Sie den Kippschalter für Argonlaser aus dem "Standby", "laser"-Lauf.</li>
	<li>Die Daten-Erfassung und Verarbeitung-Software zu starten.</li>
	<li>Den CO-2 -Controller für die Bühne Top Inkubator zu initiieren und die Konzentration von CO2 auf 5 % festgesetzt. Dies muss vor Beginn der Bildgebung.</li>
	<li>Entfernen Sie die gekammerten Deckglas aus dem Inkubator und stellen auf der Bühne für die Visualisierung. Zellen über ein Öl eintauchen 63 X Objektiv (NA1.4) zu visualisieren.</li>
	<li>Blick durch das Okular Objektive, das Bild zu konzentrieren und eine Zelle in Kernhülle Aufschlüsselung (NEBD) Phase zu identifizieren.</li>
	<li>Geeigneten Laser (488 nm Argonlaser Histone2B-GFP zu visualisieren) zu initiieren.</li>
	<li>Übernahme-Kontroll-Fenster zu öffnen und Belichtungszeit für den GFP-Kanal eingestellt. Eine Zelle im NEBD zu identifizieren.<ol>
<li>Manuell bestimmen Sie die Zielzelle oben und unten Brennebene, und geben Sie die Xyz optische Einstellungen-Schnitt.</li>
		<li>Beobachten Sie es für 20 min; Wenn die Zelle nicht durch Zellteilung fort, stoppen Sie Bildaufnahme nach 20 min zu, und fahren Sie mit der nächsten Zelle NEBD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ca. 1 h pro Zelle ist Bild rückständigen Chromosomen während der Mitose in PP2A-B56γ-Zellen notwendig, der aus der SAC entkommen. Um Daten für einen Film zu erhalten, fotografieren Sie alle 3 Minuten. Hinweis: Wildtyp Zellen zu verhaften und komme nicht voran, vorbei an NEBD wenn mit Nocodazole behandelt.</li>
	<li>Speichern von Bildern in Zvi-Datei-Format zur weiteren Analyse.</li>
</ol>6. Verarbeitung und Analyse von Bildern
Hinweis: Führen Sie dreidimensionale Bildverarbeitung und-Analyse mit jeder verfügbaren Software wie Axiovision Version 4.8.2 oder Imaris Version 8.2. Für diese Studie die ImageJ wurde Software verwendet.
<ol><li>Öffnen Sie die Bildsequenz. Wenn die Bilder bereits in einem Stapel-Format sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, kombinieren alle relevanten Bilder in einem Stapel mit "Bild > Stacks > Bilder zum Stapel" in der Menüleiste.</li>
	<li>Durchführen Sie alle Einstellungen je nach Bedarf, Helligkeit/Kontrast und Ebenen.</li>
	<li>Der Film einen Zeitstempel hinzu:<ol>
<li>Gehen Sie auf "Bild > Stacks > Label..." in der Menüleiste.</li>
		<li>Wählen Sie das entsprechende Format Zeit Startwert und der zeitliche Abstand zwischen jedem Bild.</li>
		<li>Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Vorschau" und passen Sie Speicherort und das Format Einstellungen an. Drücken Sie "OK", um den Zeitstempel anzuwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der Film eine Maßstabsleiste hinzufügen:<ol>
<li>Legen Sie die Bildskalierung unter "Analyze > Set Maßstab" in der Menüleiste.</li>
		<li>Geben Sie im Feld "Abstand in Pixel" eine Anzahl von Pixeln, wo die Entfernung bekannt ist, und geben Sie im Feld "Bekannte Distanz" den Abstand. Legen Sie die richtige Einheit der Länge für den Abstand, z. B.in µm. Drücken Sie 'OK', um die Anwendung der Skala auf den Stapel.</li>
		<li>Gehen Sie auf "Analyze > Tools > Skala Bar..." die Maßstabsleiste hinzufügen. Die Größe des Balkens als "Breite in µm", und passen Sie die verbleibenden Formatierung Optionen nach Bedarf. Kontrollkästchen Sie das "Beschriften Sie alle Scheiben" um den gesamten Stapel die Maßstabsleiste hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Vorschau des Films durch einen Klick auf den dreieckigen Play-Button am unteren linken Rand des Bildfensters. Passen Sie die Frame Rate mit "Bild > Stacks > Animation > Animationsoptionen in der Menüleiste.</li>
	<li>Exportieren Sie die Filmdatei durch die Auswahl "Datei > Speichern unter > AVI..." und wählen Sie die Bildrate und Kompression.</li>
	<li>Drücken Sie 'OK', um das Speichern wählen Speicherort und den Dateinamen. Drücken Sie "Save", um die Filmdatei speichern.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Zellzyklus Kontrolle Checkpoints, die genaue Chromosom Abtrennung sicherstellen zu verhindern, dass Aneuploidie und Zelle Transformation 1,2,3. In der vorliegenden Studie fanden wir die Inaktivierung von PP2A-B56γ führte zu einem geschwächten Spindel Baugruppe Checkpoint. Live Cell Imaging konnten wir beobachten, dass chromosomale MIS Trennung während der Mitose in PP2A-B56γ MEFs mit Nocodazole 9behandelt.
Dieses Protokoll nutzt Histone2B-GFP-Label von BacMam 2.0-Technologie, Label Chromosomen für das live Cell Imaging generiert. Einer der kritischen Schritte bei der Kennzeichnung ist Berechnung der richtige Menge von Partikeln pro Zellen (PPC), genügend Kennzeichnung zu erreichen. Durch Titration festgestellt wurde, die 10-50 PPC am besten funktioniert. Dieses Reagenz kann giftig für die Zellen; Daher ist es notwendig, PPC verwendet, um das Gleichgewicht zwischen Kennzeichnung und Toxizität auf die markierten Zellen zu titrieren. Auch dies ist eine transiente Transfektion und detektiert werden nur bis zu 5 Tage, daher möglicherweise nicht geeignet für Studien, die eine längere Beobachtungszeiträume rechtfertigen würde.
Traditionelle Kennzeichnung der Proteine oder DNA kann komplizierte Protokolle erfordern, aber hier benutzen wir ein Reagenz erfordern nur eine Übernachtung Inkubation mit gewünschten Zellen. Zusätzlich live Cell Imaging erfolgte mittels drehenden Scheibe konfokale Mikroskopie, die im Gegensatz zu konfokale Laser-scanning-Mikroskopie ist schneller und reduziert die Phototoxizität und bleichen Effekte in den lebenden Zellen 11. Dieses Protokoll ermöglicht einfache und bequeme Methode zur mitotische Zellen beschriften und chromosomalen Segregation im Vergleich zu den anderen Techniken wie Fische, Immunohistochemistry zu visualisieren und flow Cytometry. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Erfassung von rückständigen Bilder der Chromosomen in Mitose, die Bereitstellung von Zusatzinformationen zu denen, die mit traditionellen Immunocytochemistry, Fisch oder Flow Cytometry, wodurch es möglich ist, die Phänotypen so zu erfassen als Chromosom in Raum und Zeit zurück. Dieses Protokoll ermöglicht bequeme, schnelle und einfache Kennzeichnung von Chromosomen in unterschiedlichsten Zelllinien, Primärzellen, Stammzellen, Nervenzellen und verewigt T-Zellen 12,13,14.
Verschiedene Arten von Zelle Therapie Produkte entstehen mit der Hoffnung, abwechslungsreiche Krankheit Bedingungen 15zu behandeln. Eine der Herausforderungen bei der Entwicklung dieser Zelle Therapien beinhaltet Sicherheitsbedenken wegen Möglichkeit der genetischen Instabilität und Tumorgenese. Dieses Protokoll beschreibt eine bequeme und einfache Methode, um Label Chromosomen in unterschiedlichsten Zelltypen. In Zukunft könnte eingesetzt werden, um eine Probe zu untersuchen und zu messen, genetische Instabilität und Qualität der Zelle Therapie Produkte zu entwickeln.

In das folgende Protokoll beschreiben wir eine bequeme Methode, um die chromosomalen Segregation und mitotischen Fortschreiten im Zellzyklus in Maus embryonalen Fibroblasten mit 2 b-GFP Histone, BacMam 2.0 Kennzeichnung und live Cell Imaging zu visualisieren.
Zellzyklus Kontrolle Checkpoints überwachen Chromosom Abtrennung und spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der die genetische Integrität der Zelle 1,2,3. Ansammlung von MIS getrennten Chromosomen führt zu Aneuploidie, die ist ein Markenzeichen von soliden Tumoren 4. Daher, Erkennung von rückständigen Chromosomen als Methode lässt sich um chromosomale Instabilität zu studieren.
Proteine können verwendet werden, live Chromosom Abtrennung zu visualisieren und chromosomalen hinkt aber die Generation der mCherry-Tags oder H2B-GFP markiert Protein erfordert umfangreiches Wissen von gen Lieferung und Molekularbiologie 5Eindringmittel gekennzeichnet. Hier beschreiben wir die Verwendung von CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0-Reagenz, CL-HB Regent, der Einfachheit halber nachfolgend genannt. Dieses Reagenz ist sofort einsetzbar und damit Bedenken Vektor Qualität und Integrität. Darüber hinaus erfordert das Reagenz nicht den Einsatz von potenziell schädlichen Behandlungen oder Lipide und Farbstoff-Loading Chemikalien. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenzmarkierungen Flecken die CL-HB-Regent unabhängig von Funktion (zB., Membranpotential). Die CL-HB-Regent kann einfach hinzugefügt, um die Zellen und Protein-Expression über Nacht inkubiert. Die CL-HB-Regent repliziert nicht in Säugetierzellen und Biosafety Niveau (BSL) 1 Labor Einstellungen verwendet werden. Auch kann dieses transiente Transfektion nach Übernachtung Inkubation für bis zu 5 Tage, genügend Zeit nachgewiesen werden, zur dynamischsten zellulären Analysen durchführen.
Alternativ konnte Chromosomenanomalien durch verschiedene Techniken wie Durchflusszytometrie, Immunohistochemistry oder Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) 6untersucht werden. Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um Aneuploidie, die gemessen werden kann anhand der DNA-Gehalt und die Phase der Zellen in den Zellzyklus zu studieren. Obwohl Durchflusszytometrie Aneuploidie Messen verwendet werden kann, bietet es keine Informationen auf MIS chromosomalen Segregation. Fisch und immunhistochemische Techniken verwenden fluoreszierende Sonden binden an DNA oder Chromosomen. Obwohl diese Techniken eine Momentaufnahme des Status von einer Bevölkerung der Zellen bieten, erlauben sie nicht live Cell imaging, dadurch fehlen Informationen, die durch räumlich-zeitliche Visualisierung der Zytokinese in bestimmten Zellen, die über einen bestimmten Zeitraum hinweg verfolgt.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um rückständige Chromosomen oder chromosomalen MIS Segregation im Nocodazole behandelt Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) von PP2A-B56γ-Mäusen isoliert zu studieren. Zusätzlich zu oben Anwendung bietet dieses Protokoll ein einfaches Tool zum Beschriften und chromosomalen Segregation in verschiedenen Zelltypen, die zur Regulierung des Zellzyklus Untersuchung oder chromosomale Instabilität in Tumorzellen zu visualisieren. Darüber hinaus kann es auch chromosomale Instabilität verursacht durch verschiedene medikamentöse Behandlungen zu studieren oder Studie zu den Auswirkungen von gen Knock-out führt MIS chromosomalen Segregation verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered saline</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>EMD Millipore</td><td>MX 1458-6</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vial storage boxes</td><td>Fisherbrand</td><td>10-500-28</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials</td><td>Corning/costar</td><td>431416</td><td></td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Cellstar</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>2 well chambered cover glass</td><td>Nunc</td><td>155380PK</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision Cell Profiler</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer Vision Trio</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Zeiss Cell Observer SD</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thermoscientific</td><td>280 series</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo commercial solutions</td><td>MCO-18AIC (UV)</td><td></td></tr><tr><td>Class II Biological safety cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SterilGard</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision software</td><td>Zeiss</td><td>Ver.4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institute of Health</td><td>Ver. 1.51r</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

Chromosomen müssen zuverlässig und gleichmäßig in Tochterzellen während der mitotische Zellteilung getrennt werden. Treue der chromosomalen Segregation wird durch mehrere Mechanismen gesteuert, die die Spindel Baugruppe Checkpoint (SAC) enthalten. Der SAC ist Teil eines komplexen Feedbacksystems, das Prävention einer Zelle Fortschritte durch Mitose zu verantworten hat, es sei denn alle chromosomalen Kinetochore angebracht haben, um die Mikrotubuli Spindel. Chromosomale rückständigen und abnorme Chromosom Segregation ist ein Indikator der dysfunktionalen Zellzyklus Kontrolle Checkpoints und kann verwendet werden, um die genomische Stabilität der teilenden Zellen zu messen. Deregulierung des SAC kann die Umwandlung von einer normalen Zelle in einer malignen Zelle durch die Anhäufung von Fehlern während der chromosomalen Segregation führen. Umsetzung des SAC und die Bildung von komplexen Kinetochor sind streng reguliert durch Wechselwirkungen zwischen Kinasen und Phosphatase wie Protein Phosphatase 2A (PP2A). Dieses Protokoll beschreibt live Cell Imaging rückständiger Chromosomen in Maus embryonalen Fibroblasten isoliert von Mäusen, die einen Ko von der regulatorischen Untereinheit PP2A-B56γ hatte. Diese Methode überwindet die Mängel anderer Zellzyklus Kontrolle bildgebender Verfahren wie Durchflusszytometrie oder Immunocytochemistry, die nur eine Momentaufnahme eines Zelle Zytokinese Status anstelle einer dynamischen räumlich-zeitliche Visualisierung der Chromosomen während der Mitose.

MEFs vom Wildtyp und PP2A-B56γ-Mäuse waren in einem 2-Well-Kammer Abdeckung Glas ausgesät und legen durfte. Am 2. Tag, MEFs wurden synchronisiert mit 0,1 % FBS für 24 h. Am 3. Tag, MEFs in Medien mit 200 ng/mL inkubiert Nocodazole und 30 PPC CL-HB Regentwere 18 h bei 37° C und 5 % CO2. Am 4. Tag wurden die Zellen abgebildet mit einem drehenden Scheibe confocal Mikroskopsystem (Abbildung 1). Live Cell Imaging wurde verwendet, um das Schicksal der einzelnen Zellen zu visualisieren, wie sie von NEBD durch Mitose (Abbildung 2) entwickelt. Nocodazole ist bekannt, der Wildtyp-Zellen in G2M-Phase zu verhaften, durch Bildung von Mikrotubuli zu stören. Zellen im oberen Panel Metaphase (Abbildung 2) verhaftet wurden wurde, dass Post Nocodazole Behandlung Wildtyp beobachtet. Wir beobachteten, dass mangelnde PP2A-B56γ der Zellzyklus-Kontrolle geschwächt ermöglichte MEFs B56γ PP2A Zellzyklus Festnahme induziert durch Nocodazole 9zu überwinden. Darüber hinaus wurde abnormal chromosomalen Segregation in 62 % (13 von 21) der mitotischen PP2A-B56γ-MEFs behandelt mit Nocodazole (dargestellt durch die gelben Pfeile im unteren Bereich in Abbildung 2) nachgewiesen. Fünf der PP2A-B56γ-MEFs an NEBD verhaftet und 3 ging durch Mitose ohne erkennbare Mängel. Im Gegensatz dazu alle 21 Wildtyp-Zellen, die abgebildet waren ist nicht fortgeschritten, durch Mitose und erwiesen sich als durch die Metaphase (obere Leiste Abbildung 2) verhaftet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57389/57389fig1.jpg"> Abbildung 1 . Standardflussdiagramm für das live Cell Imaging. MEFs von Wildtyp und PP2A-B56γ-Mäusen wurden über Nacht in einem 2-gut gekammerten Abdeckung Glas ausgesät. Tag2 Zellen wurden synchronisiert mit 0,1 % FBS für 24 h Tag 3, Zellen, mit 200 ng/mL Nocodazole in Wachstumsmedien und 30 PPC Histon 2 b-GFP behandelt wurden, BacMam 2.0-Reagenz für 18 h am 4. Tag die Zellen wurden mit Spinning-Disk-confocal Mikroskop-System abgebildet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57389/57389fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57389/57389fig2.jpg"> Abbildung 2. Chromosomenanomalien in PP2A-B56γ-MEFs erkannt werden. Zeit Ablauf Mikroskopie live-Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten in Mitose (0-51 min) Nocodazole behandelt Wildtyp und PP2A-B56γ-MEFs erfasst. Die Wildtyp-Zellen wurden in Metaphase (obere Leiste), verhaftet zu werden gefunden, während PP2A-B56γ-MEFs durch Mitose (untere Leiste) gehen konnten. Chromosomale rückständigen oder mis Segregation entnehmen bitte PP2A-B56γ-MEFs durch gelbe Pfeile im unteren Fensterbereich angezeigt. Maßstabsleiste = 5 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57389/57389fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und bequeme Methode zum Beschriften und visualisieren live Chromosomen in mitotischen Zellen mit Histone2B-GFP BacMam 2.0-Gütezeichen und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie System.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

live-cell-imaging-of-chromosome-segregation-during-mitosis

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Serie: Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Forschung

Krebsforschung

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetik

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Neurowissenschaften

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologie

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

Studieren mitotischen Checkpoint durch Veranschaulichung Dynamische Kinetochor Protein Verhalten und Chromosome Motion in Lebens-<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial Embryonen

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...