Name: live cell imaging of chromosome segregation during mitosis
Uploaded: 2018-03-14T15:00:00
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우리는 박사 Guo Chiuan 웅와 박사 Bharatkumar 조시 원고를 개선 하는 소중한 의견에 감사 하 고 싶습니다.

이러한 연구에서 실시 한 모든 실험 프로토콜 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 연구 시설에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인에 따라 수행 했다.
1. 격리와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 문화
<ol><li>표준 프로토콜 7,,89마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) PP2A-B56γ-마우스 긴장과 야생 타입 litter...

<ol>
	<li>Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+in+CIN:+Mitotic+Infidelity+and+Its+Consequences+for+Tumor+Promotion+and+Suppression.">Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression.</a> Dev Cell. 39, 638-652 (2016).</li><li>Etemad, B., Kops, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+issues:+kinetochore+transformations+and+spindle+checkpoint+silencing.">Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing.</a> Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).</li><li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle+assembly+checkpoint.">The spindle assembly checkpoint.</a> Curr Biol. 22, 966-980 (2012).</li><li>Jallepalli, P. V., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+segregation+and+cancer:+cutting+through+the+mystery.">Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery.</a> Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+protein+CSPP1+interacts+with+CENP-H+protein+to+coordinate+accurate+chromosome+oscillation+in+mitosis.">Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis.</a> J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).</li><li>Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+and+implication+of+genome+instability+in+cancer.">The detection and implication of genome instability in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).</li><li>Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+phosphatase+2A+B56&#947;+regulatory+subunit+is+required+for+heart+development.">The protein phosphatase 2A B56&#947; regulatory subunit is required for heart development.</a> Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).</li><li>Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PP2A-B56&#947;+is+required+for+an+efficient+spindle+assembly+checkpoint.">PP2A-B56&#947; is required for an efficient spindle assembly checkpoint.</a> Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).</li><li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschl&#228;ger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle.">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+Way+You+Slice+It-A+Comparison+of+Confocal+Microscopy+Techniques.">Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques.</a> J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).</li><li>Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+reveals+LINC+complex+recruitment+at+nuclear+indentation+sites.">Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites.</a> Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).</li><li>Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spindle+Assembly+Checkpoint+Is+Not+Essential+for+Viability+of+Human+Cells+with+Genetically+Lowered+APC/C+Activity.">The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity.</a> Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).</li><li>Iuso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+Expression+of+Human+Protamine+1+(hPrm1)+Remodels+Fibroblast+Nuclei+into+Spermatid-like+Structures.">Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures.</a> Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).</li><li>Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+perspectives+on+stem+cell-based+therapies+undergoing+clinical+trials+for+regenerative+medicine:+case+studies.">Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies.</a> Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).</li></ol>

정확한 염색체 분리를 보장 하는 세포 주기 통제 검문소 방지 이수성 및 셀 변환 1,2,3. 현재 연구에서 우리는 PP2A B56γ의 그 비활성화 발견 약화 스핀 들 어셈블리 검사점 귀착되 었 다. 라이브 셀 이미징을 사용 하 여 nocodazole 9PP2A B56γ MEFs 유사 분열 동안 염색체 미 분리 처리를 관찰할 수 있었습니다.
<p class=...

다음 프로토콜에서 우리 염색체 분리 및 마우스 미 발달 섬유 아 세포 히스톤 2B-GFP, BacMam 2.0 라벨 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여에서 세포 주기 동안 mitotic 진행을 시각화 하는 편리한 방법을 설명 합니다.
세포 주기 통제 검문소 염색체 분리를 모니터링 하 고 셀 1,2,3의 유전 무결성의 유지 관리에 중요 한 역할. 미 분리 된 염색체의 이수성, 가장 단단한 종양 4의 특징은 발생할 수 있습니다. 따라서, 후행 염색체의 염색체 불안정성을 공부 하는 방법으로 사용할 수 있습니다.
붙일 표시 또는 라이브 염색체 분리를 시각화 하는 데 사용 하 고 mCherry 태그의 생성 하지만 후행 염색체 단백질 수 태그 H2B GFP 단백질 유전자 전달 및 분자 생물학 5의 상당한 지식이 필요 합니다. 여기는 CL-HB는 리 젠 트, 편의 위해이 전화 CellLight Histone2B GFP BacMam 2.0 시 약의 사용에 설명 합니다. 이 시는 즉시 사용할 수 있습니다 하 고 따라서 벡터 품질 및 무결성에 대 한 우려를 제거 합니다. 또한,이 시는 잠재적으로 유해한 치료 또는 지질 및 염료 선적 화학 물질의 사용을 필요 하지 않습니다. 기존의 형광 라벨, 달리 CL-HB 리 젠 트 기능에 독립적으로 얼룩 (즉., 막 잠재력). CL HB 리 젠 트를 단순히 셀에 추가 하 고 단백질 식 밤새 껏 알을 품 수 수 있습니다. CL HB 섭정 포유류 세포에서 복제 하지 않습니다 그리고 biosafety 수준 (BSL) 1 실험실 설정에서 사용할 수 있습니다. 또한, 가장 역동적인 세포 분석을 수행 하 후 최대 5 일까지 충분 한 시간 동안 야간 보육이 과도 transfection은 감지할 수 있습니다.
또는, 염색체 이상이 cytometry, immunohistochemistry 또는 형광 제자리 교 잡 (물고기) 6등 다양 한 기법에 의해 공부 될 수 있었다. Cytometry는 이수성, 측정 될 수 있는 DNA 콘텐츠 및 세포 주기 세포의 단계에 따라 공부를 사용할 수 있습니다. Cytometry 이수성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만 그것은 염색체 미 분리에 정보를 제공 하지 않습니다. 물고기와 immunohistochemistry 기술 DNA 또는 염색체에 바인딩할 형광 프로브를 사용 합니다. 이러한 기술은 세포의 인구 상태 스냅숏을 제공, 그들은 라이브 셀 이미징 함으로써 특정 셀 시간의 기간 동안 다음에 cytokinesis spatiotemporal 시각화를 통해 얻은 정보를 누락을 허용 하지 않습니다.
이 프로토콜은 지체 염색체 또는 염색체 미 분리 취급 하는 nocodazole 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)에 PP2A-B56γ-마우스에서 분리 연구 하 사용 되었다. 응용 프로그램 위에 이외에,이 프로토콜 레이블 및 세포 주기 규칙을 공부 하는 데 사용할 수 있는 다양 한 셀 형식에 염색체 분리 또는 종양 세포의 염색체 불안정을 시각화 하는 간단한 도구를 제공 합니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 다양 한 약물 치료에 의해 발생 하는 염색체 불안정을 공부 하거나 유전자 염색체 미 분리의 결과로 밖으로 노크의 효과 연구.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:644px;" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:128px;">11320082</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:191px;">MEM Non-Essential amino acids solution (100X)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered saline</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td align="right">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:135px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td style="width:135px;">EMD Millipore</td>
			<td>MX 1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryogenic vial storage boxes</td>
			<td style="width:135px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:128px;">10-500-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Cryogenic vials</td>
			<td style="width:135px;">Corning/costar</td>
			<td align="right">431416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:135px;">Cellstar</td>
			<td align="right" style="width:128px;">658175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">2 well chambered cover glass</td>
			<td style="width:135px;">Nunc</td>
			<td style="width:128px;">155380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Cellometer Vision Cell Profiler</td>
			<td style="width:135px;">Nexcelom Bioscience LLC</td>
			<td style="width:128px;">Cellometer Vision Trio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:135px;">Sigma</td>
			<td style="width:128px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:135px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:128px;">C10594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:191px;">Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system</td>
			<td style="width:135px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td style="width:128px;">Zeiss Cell Observer SD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Water Bath</td>
			<td style="width:135px;">Thermoscientific</td>
			<td style="width:128px;">280 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Incubator</td>
			<td style="width:135px;">Sanyo commercial solutions</td>
			<td style="width:128px;">MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">Class II Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:135px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:128px;">SterilGard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:191px;">Axiovision software</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:128px;">Ver.4.8.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:191px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:135px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:128px;">Ver. 1.51r</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live cell imaging of chromosome segregation during mitosis

염색체 해야 안정적이 고 균일 하 게 분리 되어 딸 세포에 mitotic 세포 분열 동안. 염색체 분리의 충실도 스핀 들 어셈블리 검사점 (SAC)을 포함 하는 여러 메커니즘을 통해 제어 됩니다. SAC 모든 염색체 kinetochores microtubules 스핀 들에 첨부 하지 않으면 세포 유사 분열 진행의 예방에 대 한 책임은 복잡 한 피드백 시스템의 일부입니다. 염색체 지체 및 비정상적인 염색체 분리 역 기능 세포 주기 통제 검문소의 표시기 이며 셀 분할의 게놈 안정성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. SAC의 규제 완화는 염색체 분리 중 오류의 축적을 통해 악성 세포로 정상 세포의 변화에 발생할 수 있습니다. SAC의 구현 및 복잡 한 kinetochore의 형성 단단히 kinases와 단백질 인산 가수분해 효소 2A 등 인산 가수분해 효소 사이 상호 작용에 의해 규제 됩니다 (PP2A). 이 프로토콜 마우스 미 발달 섬유 아 세포 했다 PP2A B56γ 규제 소 단위의 녹아웃 쥐에서 고립에서 염색체를 후행의 라이브 셀 이미징을 설명 합니다. 이 방법은 다른 세포 주기 제어 이미징 기술 cytometry 또는 immunocytochemistry 같은 염색체의 동적 spatiotemporal 시각화 대신 셀 cytokinesis 상태 스냅숏을 제공의 단점을 극복 동안 유사 분열.

야생 유형 및 PP2A-B56γ-마우스에서 MEFs 2-잘 챔버 커버 유리에 시드 되었고 첨부할 수 있습니다. 하루에 2, MEFs는 0.1%를 사용 하 여 동기화 했다 FBS 24 h에 대 한. 하루 3, MEFs 미디어에서 200 ng/mL에 nocodazole 및 30 PPC CL-HB regentwere 37에서 18 h incubated° C, 5 %CO2. 하루에 4, 셀은 회전 디스크 confocal 현미경 시스템 (그림 1)를 사용 하 여 몇 군데 있었?...

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Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

이 프로토콜 레이블 및 라이브 염색체 mitotic 세포 Histone2B GFP BacMam 2.0 레이블 및 회전 디스크 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 시각화 하는 간단 하 고 편리한 방법을 설명 합니다.

유사 분열 동안 염색체 분리의 라이브 셀 이미징

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

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애기 장대 꽃 개발의 공 촛점 이미징 라이브

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발생학

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말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

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An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

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생체 외에서 라이브 셀 이미징의 접합 자 양극 화와 애기 thaliana 패터 닝 태아 난 재배

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