Isolare i miociti atriali per l'uso in esperimenti patch-clamp ha notevolmente migliorato la nostra conoscenza e comprensione dell'elettrofisiologia atriale sia a livello cellulare che molecolare. L'approccio che utilizziamo produce efficacemente un gran numero di miociti atriali isolati che possono essere utilizzati per studiare l'elettrofisiologia atriale cellulare e l'aritmogenesi in una vasta gamma di modelli e condizioni sperimentali. Abbiamo adottato un approccio di digestione del tronco per isolare i miociti atriali.
Il vantaggio di questo approccio è che consente al ricercatore di scegliere la regione specifica che desidera indagare. Iniziare questa procedura con la preparazione di attrezzature e soluzioni come descritto nel protocollo di testo. Disporre la piastra di sezionatura, gli utensili di sezionatura, una pipetta Pasteur e le pipette lucidate per il fuoco.
Questo protocollo può essere eseguito su topi maschi o femmine di tipo selvatico, topi che portano mutazioni genetiche e modelli di malattie del topo. Dopo l'eutanasia del mouse come descritto nel protocollo di testo, posizionare il mouse su un tovagliolo di carta o sughero e rastrelere le zampe verso il basso per tenere il mouse in posizione. Bagnare il petto del topo con il 70% di etanolo.
Rimuovere la pelliccia e la pelle che coprono il petto usando forbici curve. Quindi utilizzare le flesse dei denti del ratto per sollevare lo sterno e quindi tagliare il diaframma lungo il bordo delle costole. Rimuovere l'intera gabbia toracica usando forbici curve per esporre il cuore.
Per rimuovere l'appendice atriale, sollevare delicatamente l'appendice utilizzando forcep di sezionatura fine e tagliarla con forbici a molla. Trasferire immediatamente l'appendice atriale in una sezionatura rivestita di silicio contenente 20 millilitri di soluzione pH 7.4 di Tyrode modificata riscaldata. Posizionare un perno di sezionatura nella parte superiore e un perno nella parte inferiore dell'apertura dell'appendice atriale.
Utilizzando una pipetta Pasteur, sciacquare l'atria con la soluzione di pH 7.4 del Tyrode modificata riscaldata per rimuovere il sangue. Aprire l'appendice atriale tagliando lungo il bordo superiore e inferiore. Quindi, fissare gli angoli dell'appendice atriale verso il basso per creare un pezzo di tessuto rettangolare piatto.
Tagliare l'appendice atriale in circa otto-10 strisce di dimensioni uguali usando forbici a molla e forcep fini. Si noti che le strisce si contraggono una volta tagliate libere dal pezzo principale di tessuto. Utilizzando la pipetta lucidata a fuoco piccolo al foro, trasferire le strisce di tessuto nel primo tubo contenente la soluzione di pH 6.9 di Tyrode modificata riscaldata.
Aspetta cinque minuti. Ora, utilizzare la pipetta lucidata a fuoco a foro medio per trasferire le strisce di tessuto al secondo tubo bottomed rotondo contenente la soluzione pH 6.9 del Tirolo modificata. Per lavare le strisce di tessuto, cappuccio il tubo con fondo rotondo da cinque millilitri e invertire delicatamente il tubo tre volte.
Lasciare che le strisce di tessuto si sistemino sul fondo del tubo prima di trasferire le strisce di tessuto al terzo tubo utilizzando la pipetta lucidata a fuoco a foro medio. Lavare di nuovo le strisce per inversione. Quindi, trasferire le strisce tissutali nella soluzione enzimatica utilizzando una pipetta lucidata a fuoco medio e incubare per 30 minuti.
Ruotare il tubo ogni tre o cinque minuti per evitare che le strisce di tessuto aderiscano insieme. All'inizio della digestione enzimatica, le strisce tissutali si depositano rapidamente dopo il vortice. A circa 20 minuti di digestione, le strisce tissutali iniziano a galleggiare nella soluzione enzimatica dopo il vortice.
Durante questo periodo, le strisce di tessuto atriale cambiano anche nell'aspetto dal rosa pallido al bianco mentre vengono digerite. Dopo la digestione enzimatica, eseguire tre lavaggi utilizzando soluzione da 2,5 millilitri di KB nei tubi a fondo rotondo da cinque millilitri preparati. Per ogni lavaggio, invertire delicatamente il tubo tre volte prima di spostare il tessuto sul tubo successivo utilizzando la pipetta lucidata a fuoco a foro medio.
Dopo il lavaggio finale, trasferire le strisce nel tubo a fondo rotondo da 14 millilitri contenente soluzione da 2,5 millilitri di KB. Aspetta cinque minuti. Triturare delicatamente il tessuto per 7,5 minuti utilizzando la pipetta lucidata a fuoco a foro largo.
Ciò dissocia meccanicamente le strisce tissutali e produce una soluzione torbide piena di singoli miociti atriali. Il primo della triturazione deve essere adattato per produrre un gran numero di cellule senza danni alle cellule. Considera fattori come l'età dei topi e le condizioni della malattia.
Adattare la forza della triturazione all'isolamento individuale alterando sia la frequenza che la velocità di espulsione delle strisce tissutali dalla pipetta lucidata a fuoco a foro largo. Una triturazione delicata si traduce in una bassa resa cellulare, mentre una forte triturazione produrrà molte cellule morte. Riempire il tubo a fondo rotondo da 14 millilitri contenente le strisce di tessuto triturato con soluzione KB ad un volume finale da sette a 10 millilitri a seconda della densità desiderata delle cellule per uso sperimentale.
Posizionare questo tubo a temperatura ambiente per un'ora. Dopo questo periodo di incubazione, le cellule possono essere utilizzate per una varietà di esperimenti per un massimo di sette ore. Ecco alcuni esempi di miociti atriali isolati da topi normali.
I miociti atriali isolati sono tipicamente dell'ordine di 100 micron di lunghezza e 10 micron di larghezza con striature chiare. La capacità dei miociti atriali isolati è tipicamente da 40 a 70 picofarad. Viene mostrato un esempio di potenziale di azione del miocita atriale registrato utilizzando la tecnica del patch-clamp perforato in modalità di bloccaggio corrente.
Una famiglia rappresentativa di correnti di sodio è stata registrata nell'intera configurazione cellulare della tecnica patch-clamp. Queste correnti sono state registrate utilizzando passaggi di morsetto di tensione di 50 millisecondi tra -100 e 10 millivolt positivi da un potenziale di tenuta di 120 millivolt negativi. Qui viene presentata una relazione riassuntiva della tensione di corrente di sodio.
Una famiglia rappresentativa di correnti di calcio è stata registrata utilizzando passaggi di morsetto di tensione di 250 millisecondi tra -60 e 80 millivolt positivi da un potenziale di tenuta di 70 millivolt negativi. Qui viene visualizzata una relazione riepilogativo della tensione di corrente di calcio. Una famiglia rappresentativa di correnti di potassio è stata registrata da un potenziale di tenuta di 80 millivolt negativi utilizzando passaggi di morsetto di tensione di 500 millisecondi tra passi di morsetto di tensione negativi 120 millivolt e 80 millivolt positivi.
Qui viene mostrata la relazione di tensione di corrente di riepilogo per la corrente totale di potassio. È importante ricordare che un riuscito isolamento del miocita atriale dipende sia da un'appropriata digestione enzimatica che da una dissociazione meccanica delle cellule durante la triturazione. Una volta isolati, i miociti atriali possono essere utilizzati in esperimenti di patch-clamp per le misurazioni della morfologia del potenziale d'azione e delle correnti ioniche, come correnti di sodio, correnti di calcio e correnti di potassio.
Lo studio dei cambiamenti nell'elettrofisiologia atriale dei miociti è stato essenziale per determinare le basi cellulari e molecolari delle aritmie atriali potenzialmente letali e per lo sviluppo e la sperimentazione di composti antiaritmici per aritmie atriali.
