El creciente interés en el estudio de grandes estructuras multicelulares condujo al desarrollo de esta técnica de compensación óptica que permite una visualización tridimensional y cuantificación de grandes estructuras dentro de órganos transparentes. Este protocolo proporciona una herramienta simple, barata, fácil de configurar y completa para investigar el tejido en tres dimensiones. La naturaleza multicapa de una enfermedad no siempre puede ser simulada por técnicas bidimensionales tradicionales.
El análisis tridimensional del tejido puede ayudar a diagnosticar y controlar mejor la enfermedad. Este método no se limita al tejido renal y se puede aplicar a cualquier tejido normal y enfermo. Este sencillo protocolo es fácil de seguir para cualquier científico con cierta experiencia en el manejo de animales.
Es importante probar diferentes anticuerpos en caso de etiquetado de anticuerpos deficientes, y llevar a cabo controles secundarios de anticuerpos sólo controles. Comience preparando la heparina que contiene PBS y el 3,0% de paraformaldehído en 1X PBS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y transfiriendo las soluciones a jeringas de plástico separadas de 50 ml. El paraformaldehído es tóxico y debe prepararse en la campana de humos.
Recoger y profusar el riñón de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, retire la cápsula y corte el riñón en rodajas coronales de un mm de espesor. Sumerja las rodajas renales con la solución de paraformaldehído preparada en un tubo cónico de 15 ml.
Después de la fijación, lave la rebanada de riñón dos veces con un tampón de lavado 1X durante una hora en un balancín horizontal y luego proceda con la recuperación de antígenos. Calentar 300 ml de solución de desenmascarante de 1x antígeno en un vaso de precipitados de 500 ml. Luego, encierre una rebanada de riñón en un cassette incrustado permeable al tampón calentado y revuelva durante una hora a 92 a 98 grados centígrados.
Es importante mantener la temperatura estable entre 92 y 98 grados Celsius para este paso de recuperación de antígeno. A continuación, transfiera la rebanada a 10 ml de tampón de lavado 1X con 0,1%Tritón X-100 y estremece durante la noche. Al día siguiente, lave la rodaja dos veces con 10 ml de tampón de lavado 1X fresco durante una hora.
Diluir el anticuerpo primario en 500 microlitros de diluyente de anticuerpos normales. Mece suavemente la rebanada de riñón en un anticuerpo primario diluido durante cuatro días a 37 grados centígrados. Después de la incubación, lave la rodaja de riñón en 10 ml de tampón de lavado 1X durante la noche a temperatura ambiente, cambiando el tampón una vez después de ocho horas.
Diluir los anticuerpos secundarios en 500 microlitros de diluyente de anticuerpos normales e incubar con la rebanada renal durante cuatro días a 37 grados centígrados. Tenga en cuenta que a partir de este paso hacia adelante, la rebanada de riñón debe protegerse de la luz. Después de la incubación con anticuerpos secundarios, lave la rodaja de riñón en 10 ml de tampón de lavado 1X durante la noche a temperatura ambiente.
Para deshidratar la rebanada de riñón, transfiéralo a cinco ml de 100% etanol de alto grado y mece durante dos horas a temperatura ambiente, refrescando el etanol después de una hora. Sumerja la rodaja de riñón en dos ml de cinnamato etílico y mece suavemente durante la noche. Cuando esté listo para tomar una imagen del tejido, agregue de 600 a 1000 microlitros de cinnamato etílico en un plato de fondo de vidrio y transfiera la rebanada de riñón al plato.
Coloque un resguardo redondo de la cubierta en la rebanada de riñón y selle el plato con película de parafina. Coloque el plato en la plataforma de imágenes del microscopio e imagen del tejido de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Este protocolo se ha utilizado para realizar con éxito análisis 3D en el tejido renal y evaluar las funciones e interacciones celulares.
El método puede causar temple fluorescente reportero, pero otras proteínas fluorescentes fuertes pueden resistir el enfriamiento de la señal. La profusión aórtica abdominal puede mejorar la difusión de anticuerpos. En algunos casos, la mala penetración de anticuerpos da como resultado una señal superficial.
Esto se puede corregir con concentraciones más altas o reposición de anticuerpos. Se debe considerar el parto intravascular si el antígeno de interés se expresa en vasculatura renal. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos a proteínas en la membrana apical de las células epiteliales del túbulo no cruzan la barrera de filtración glomerular y causan señales inespecíficas.
El tejido se puede etiquetar con los anticuerpos para detectar una población celular específica o para visualizar segmentos enteros de tubulos. Además, la colocación de proteínas en 3D se puede lograr combinando múltiples anticuerpos. Es importante recordar que el etiquetado de anticuerpos se puede mejorar con una buena profusión renal, el uso de paso de recuperación de antígenos y una alta concentración de anticuerpos.
Algunas proteínas reporteras fuertes pueden resistir el enfriamiento de la señal fluorescente siguiendo este protocolo. Para probar esto, omita los pasos de recuperación de antígenos y etiquetado de anticuerpos. Esta técnica respeta la naturaleza tridimensional de las estructuras y abre muchas nuevas áreas para la investigación.
Elimina las suposiciones e interferencias requeridas asociadas con el análisis bidimensional tradicional.
