Name: optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00
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T. S. cuenta con el apoyo de subvenciones de la DFG German Research Foundation (332853055), Else Kr'ner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) y la Facultad de Medicina de la RWTH Aachen (Programa de Retorno RWTH). V. G. P. cuenta con el apoyo de becas de investigación de Deutsche Gesellschaft fur Nephrologie, la Fundación Alexander von Humboldt y el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia. D. H. E es apoyado por la Fundación LeDucq. R. K. cuenta con el apoyo de subvenciones del DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), el Estado de Northrhinewestfalia (MIWF-NRW) y el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de la Universidad RWTH Aachen (O3-11).

NOTA: Todos los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón, Portland, Oregón, EE. UU., y las autoridades locales pertinentes en Aquisgrán, Alemania.
1. Perfusión aórtica abdominal retrógrada y fijación de riñones de ratón
<ol><li>Prepare las soluciones el mismo día o la noche anterior y guárdelas en una nevera durante la noche. Soluc...

<ol>
	<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain.">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li><li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron.">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Puelles, V. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+tissue+clearing.">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ClearT:+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue.">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Susaki, E. 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(118), (2016).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO.">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916 (2012).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method.">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding.">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li><li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain.">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007 (2018).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli.">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li><li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis.">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling.">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li><li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure.">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li><li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data.">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDISCO:+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs.">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355 (2019).</li><li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution.">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing.">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li><li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells.">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039 (2013).</li><li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis.">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596 (2019).</li><li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li><li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+(FACT)-an+optimized+new+protocol+for+rapid,+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue.">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895 (2017).</li><li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization.">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li><li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs.">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248 (2018).</li></ol>

Las técnicas de limpieza óptica han recibido una amplia atención para la visualización tridimensional y la cuantificación de la microanatomía en diversos órganos. Aquí, el método de limpieza a base de disolventes (ECi) se combinó con el inmunoetiquetado para imágenes tridimensionales de túbulos enteros en rodajas renales. Este método es simple, barato y rápido. Sin embargo, otras preguntas de investigación pueden ser mejor respondidas con otros protocolos de compensación5. También...

El creciente interés en estudiar órganos enteros o grandes estructuras multicelulares ha llevado al desarrollo de métodos de limpieza óptica que implican imágenes de tejido transparente en tres dimensiones. Hasta hace poco, los mejores métodos para estimar el número de células, la longitud o el volumen de estructuras enteras han sido la estereología o la sección serial exhaustiva, que se basa en el muestreo sistémico de tejido para su posterior análisis en dos dimensiones1, 2 , 3. Sin embargo, estos métodos consumen mucho tiempo y necesitan un alto nivel de formación y experiencia4. Los métodos de limpieza óptica superan estos problemas equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para hacer que el tejido sea translúcido para imágenes 3D5,6,7.
Se han desarrollado varios métodos de compensación óptica que se dividen en dos categorías principales: métodos basados en disolventes y acuosos. Los métodos acuosos se pueden dividir aún más en una inmersión simple8,9, hiperhidratación10,11,e hidrogel incrustando12,13. Los métodos a base de disolventes deshidratan el tejido, eliminan los lípidos y normalizan el índice de refracción a un valor alrededor de 1,55. Las limitaciones de la mayoría de los métodos basados en disolventes son el enfriamiento de la fluorescencia endógena de proteínas de reportero de uso común como GFP, toxicidad de disolventes, capacidad para disolver los pegamentos utilizados en algunas cámaras de imágenes u lentes objetivas, y contracción del tejido durante deshidratación14,15,16,17,18,19,20,21. Sin embargo, los métodos basados en disolventes son simples, eficientes en el tiempo y pueden funcionar en varios tipos de tejidos diferentes.
Los métodos acuosos se basan en la inmersión del tejido en soluciones acuosas que tienen índicesrefractivos en el rango de 1,38-1,52 8,11,12,22,23,24 . Estos métodos fueron desarrollados para preservar la emisión de proteínas fluorescentes endógenas de reportero y prevenir la contracción inducida por la deshidratación, pero las limitaciones de la mayoría de los métodos de limpieza a base acuosa incluyen una mayor duración del protocolo, expansión de tejidos y modificación proteica (es decir, desnaturalización parcial de proteínas por urea en protocolos hiperhidratantes como ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS abordó la expansión del tejido mediante la combinación de urea con sorbitol, que contrarresta por deshidratación la expansión del tejido inducida por la urea, y preserva la ultraestructura del tejido según lo evaluado por la microscopía electrónica10. La contracción o expansión del tejido afecta a los tamaños absolutos de las estructuras, las distancias entre los objetos o la densidad celular por volumen; por lo tanto, la medición de los cambios de tamaño al limpiar el tejido puede ayudar a interpretar los resultados obtenidos7,26.
En general, un protocolo para la compensación óptica consta de múltiples pasos, incluyendo pretratamiento, permeabilización, inmunoetiquetado (si es necesario), coincidencia de índices de refracción e imágenes con microscopía de luz avanzada (por ejemplo, bitótno, confocal o microscopía de fluorescencia de láminas de luz). La mayoría de los enfoques de limpieza se han desarrollado para visualizar el tejido neuronal, y estudios emergentes han validado su aplicación en otros órganos5. Esta completa herramienta se ha demostrado previamente para permitir un análisis fiable y eficiente de las estructuras renales, incluyendo glomérulos27,28, infiltrados inmunes28, vasculatura28,y segmentos de túbulos 29, y es un enfoque ideal para mejorar la comprensión de la función glomerular y la remodelación de túbulos en salud y enfermedades.
Aquí se resume un método a base de disolvente que combina inmunomanchado de túbulos renales; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar (ECi); y la imagen por microscopía confocal que permite la visualización y cuantificación completa de los túbulos. Este método es simple, combina la recuperación de antígenos de rodajas de riñón con la tinción de anticuerpos comerciales, y no requiere equipo especializado, lo que lo hace accesible a la mayoría de los laboratorios.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 gauge butterfly needle</td>
			<td>Braun</td>
			<td>Venofix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way stopcock</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>K420163-4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>IMARIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D analyis software</td>
			<td>Cellprofiler</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml plastic syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU monoclonal antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S0809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-647</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate-based antigen retrieval solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved hemostat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-812-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Wash Buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Motic</td>
			<td>DSK-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding cassettes</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>E478.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl cinnamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>112372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexible film/Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-AQP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-NKCC2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P074.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sagent Pharmaceuticals</td>
			<td>401-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemostat</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>312-471-140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horizontal rocker</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>S2035-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging dish</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>501090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro serrefine</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>Merit</td>
			<td>97-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-phoshoThr53-NCC</td>
			<td>PhosphoSolutions</td>
			<td>p1311-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>World Precision Instruments Kwik-Sil</td>
			<td>KWIK-SIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRA001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC215682500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Lancer</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>MWI Animal Health</td>
			<td>AnaSed Inj SA (Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue

Las técnicas de limpieza óptica hacen que el tejido sea transparente equilibrando el índice de refracción a lo largo de una muestra para imágenes tridimensionales posteriores (3-D). Han recibido gran atención en todas las áreas de investigación por el potencial de analizar estructuras microscópicas multicelulares que se extienden a lo largo de distancias macroscópicas. Dado que los túbulos renales, la vasculatura, los nervios y los glomérulos se extienden en muchas direcciones, que sólo han sido capturados parcialmente por técnicas bidimensionales tradicionales hasta el momento, la limpieza de tejidos también abrió muchas nuevas áreas de investigación renal. La lista de métodos de compensación óptica está creciendo rápidamente, pero sigue siendo difícil para los principiantes en este campo elegir el mejor método para una pregunta de investigación dada. Aquí se proporciona un método simple que combina el etiquetado de anticuerpos de rebanadas gruesas de riñón de ratón; limpieza óptica con canela etílico química barata, no tóxica y lista para usar; e imágenes confocales. Este protocolo describe cómo perfumar los riñones y utilizar un paso de recuperación de antígenos para aumentar la unión de anticuerpos sin necesidad de equipos especializados. Su aplicación se presenta en imágenes de diferentes estructuras multicelulares dentro del riñón, y se aborda cómo solucionar la mala penetración de anticuerpos en el tejido. También discutimos las posibles dificultades de la toma de imágenes de fluoróforos endógenos y la adquisición de muestras muy grandes y cómo superarlas. Este sencillo protocolo proporciona una herramienta completa y fácil de configurar para estudiar el tejido en tres dimensiones.

Los riñones son órganos complejos compuestos por 43 tipos de células diferentes31. La mayoría de estas células forman grandes estructuras multicelulares como glomérulos y túbulos, y su función depende en gran medida de las interacciones entre sí. Las técnicas histológicas 2D clásicas capturan parcialmente estas grandes estructuras y pueden pasar por alto los cambios focales dentro de las estructuras intactas31. Por lo tanto, el análisis 3D utilizando técnicas ...

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Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

El creciente interés en el estudio de grandes estructuras multicelulares condujo al desarrollo de esta técnica de compensación óptica que permite una visualización tridimensional y cuantificación de grandes estructuras dentro de órganos transparentes. Este protocolo proporciona una herramienta simple, barata, fácil de configurar y completa para investigar el tejido en tres dimensiones. La naturaleza multicapa de una enfermedad no siempre puede ser simulada por técnicas bidimensionales tradicionales.El análisis tridimensional del tejido puede ayudar a diagnosticar y controlar mejor la enfermedad. Este método no se limita al tejido renal y se puede aplicar a cualquier tejido normal y enfermo. Este sencillo protocolo es fácil de seguir para cualquier científico con cierta experiencia en el manejo de animales.Es importante probar diferentes anticuerpos en caso de etiquetado de anticuerpos deficientes, y llevar a cabo controles secundarios de anticuerpos sólo controles. Comience preparando la heparina que contiene PBS y el 3,0% de paraformaldehído en 1X PBS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y transfiriendo las soluciones a jeringas de plástico separadas de 50 ml. El paraformaldehído es tóxico y debe prepararse en la campana de humos.Recoger y profusar el riñón de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego, retire la cápsula y corte el riñón en rodajas coronales de un mm de espesor. Sumerja las rodajas renales con la solución de paraformaldehído preparada en un tubo cónico de 15 ml.Después de la fijación, lave la rebanada de riñón dos veces con un tampón de lavado 1X durante una hora en un balancín horizontal y luego proceda con la recuperación de antígenos. Calentar 300 ml de solución de desenmascarante de 1x antígeno en un vaso de precipitados de 500 ml. Luego, encierre una rebanada de riñón en un cassette incrustado permeable al tampón calentado y revuelva durante una hora a 92 a 98 grados centígrados.Es importante mantener la temperatura estable entre 92 y 98 grados Celsius para este paso de recuperación de antígeno. A continuación, transfiera la rebanada a 10 ml de tampón de lavado 1X con 0,1%Tritón X-100 y estremece durante la noche. Al día siguiente, lave la rodaja dos veces con 10 ml de tampón de lavado 1X fresco durante una hora.Diluir el anticuerpo primario en 500 microlitros de diluyente de anticuerpos normales. Mece suavemente la rebanada de riñón en un anticuerpo primario diluido durante cuatro días a 37 grados centígrados. Después de la incubación, lave la rodaja de riñón en 10 ml de tampón de lavado 1X durante la noche a temperatura ambiente, cambiando el tampón una vez después de ocho horas.Diluir los anticuerpos secundarios en 500 microlitros de diluyente de anticuerpos normales e incubar con la rebanada renal durante cuatro días a 37 grados centígrados. Tenga en cuenta que a partir de este paso hacia adelante, la rebanada de riñón debe protegerse de la luz. Después de la incubación con anticuerpos secundarios, lave la rodaja de riñón en 10 ml de tampón de lavado 1X durante la noche a temperatura ambiente.Para deshidratar la rebanada de riñón, transfiéralo a cinco ml de 100% etanol de alto grado y mece durante dos horas a temperatura ambiente, refrescando el etanol después de una hora. Sumerja la rodaja de riñón en dos ml de cinnamato etílico y mece suavemente durante la noche. Cuando esté listo para tomar una imagen del tejido, agregue de 600 a 1000 microlitros de cinnamato etílico en un plato de fondo de vidrio y transfiera la rebanada de riñón al plato.Coloque un resguardo redondo de la cubierta en la rebanada de riñón y selle el plato con película de parafina. Coloque el plato en la plataforma de imágenes del microscopio e imagen del tejido de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Este protocolo se ha utilizado para realizar con éxito análisis 3D en el tejido renal y evaluar las funciones e interacciones celulares.El método puede causar temple fluorescente reportero, pero otras proteínas fluorescentes fuertes pueden resistir el enfriamiento de la señal. La profusión aórtica abdominal puede mejorar la difusión de anticuerpos. En algunos casos, la mala penetración de anticuerpos da como resultado una señal superficial.Esto se puede corregir con concentraciones más altas o reposición de anticuerpos. Se debe considerar el parto intravascular si el antígeno de interés se expresa en vasculatura renal. Sin embargo, los anticuerpos dirigidos a proteínas en la membrana apical de las células epiteliales del túbulo no cruzan la barrera de filtración glomerular y causan señales inespecíficas.El tejido se puede etiquetar con los anticuerpos para detectar una población celular específica o para visualizar segmentos enteros de tubulos. Además, la colocación de proteínas en 3D se puede lograr combinando múltiples anticuerpos. Es importante recordar que el etiquetado de anticuerpos se puede mejorar con una buena profusión renal, el uso de paso de recuperación de antígenos y una alta concentración de anticuerpos.Algunas proteínas reporteras fuertes pueden resistir el enfriamiento de la señal fluorescente siguiendo este protocolo. Para probar esto, omita los pasos de recuperación de antígenos y etiquetado de anticuerpos. Esta técnica respeta la naturaleza tridimensional de las estructuras y abre muchas nuevas áreas para la investigación.Elimina las suposiciones e interferencias requeridas asociadas con el análisis bidimensional tradicional.

Research

JoVE Journal

Medicine

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

De modo dual de imágenes de la oxigenación de los tejidos cutáneos y la función vascular

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Investigación

Medicina

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

No invasiva de medición óptica del metabolismo cerebral en lactantes y Hemodinámica

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

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Cerenkov Luminiscencia Imaging de interescapular tejido adiposo marrón

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Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

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