تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

Summary

توضح هذه المقالة تقنية زرع الانسجة التي تم تصميمها لاختبار الإشارات وخصائص الزخرفة من الأديم الظاهر سطح الرأس أثناء تطوير القحفي.

Abstract

وقد ساعدت سهولة الحصول على أجنة الطيور علم الجنين التجريبي فهم مصائر الخلايا أثناء التطور ودور الأنسجة التي تنظم التفاعلات الزخرفة والتشكل من الفقاريات (على سبيل المثال ^{، 1} ، ^{2 ، 3 ، 4).} هنا ، نحن لتوضيح أسلوب الذي يستغل هذا الوصول لاختبار الإشارات وخصائص الزخرفة الأدمة من أنسجة الوجه أثناء تطوير. في هذه التجارب ، فإننا نخلق السمان ، فرخ ⁵ أو الماوس الفرخ ⁶ من زرع الوهم في الأديم الظاهر السطحي الذي يغطي الرأس والفك العلوي من السمان أو الماوس على المنطقة إما نفسه أو في منطقة خارج الرحم لافراخ الدجاج. وقد تم تطوير استخدام السمان والأنسجة المانحة للزرع في الدجاج للاستفادة من علامة موجودة في نويي السمان ولكن الخلايا لا الفرخ ، وبالتالي السماح للمحققين تميز المضيفة والمانحة الأنسجة ^7. وبالمثل ، وهو عنصر المتكررة موجودة في جينوم الفأر ، ويعبر بتواجد مطلق ، والذي يسمح لنا أن نميز بين المضيفة والمانحة في الأنسجة الفرخ الفأر الوهم ^8. سيتم استخدام الماوس كما الأديم الظاهر تمديد الأنسجة المانحة إلى حد كبير فهمنا لهذه التفاعلات الأنسجة ، وذلك لأن هذا سوف يسمح لنا لاختبار خصائص الإشارات من الأديم الظاهر المستمدة من أجنة متحولة مختلفة.

Protocol

1. إعداد الأنسجة المانحة

1. تعد وسائل الإعلام والثقافة ، وصقل الزجاج الدبابيس ، وشحذ الإبر التنغستن.
2. جمع الجنين من قذيفة ، ويغسل في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
   1. باستخدام الحقنة 10 مل و إبرة قياس 18 مل من 1.0 إزالة الزلال من نهاية وأشار من قشرة البيضة.
   2. جعل ثقب صغير في الجزء العلوي من الغلاف باستخدام مقص نقطة ، وقطع دائرية ثم فتح للكشف عن الجنين
3. إزالة الرأس والمكان الى DMEM (المصل الحرة ، ودرجة حرارة الغرفة)
4. عملية تشريح الجبهية من الجنين (أو غيرها من الجهات المانحة مثل موقع عملية الفك العلوي أو الفك السفلي)
5. في هضم 2.4U / مل dispase في برنامج تلفزيوني على الجليد ل20mins
6. تغطية الأنسجة مع DMEM مع جيش صرب البوسنة 1 ٪ لوقف عملية الهضم
7. استخدام الإبر التنغستن شحذ إلى الأديم الظاهر منفصلة ، اللحمة المتوسطة ، وneuroectoderm
8. تخزين الأنسجة الكسب غير المشروع في جيش صرب البوسنة DMEM 1 ٪ على الجليد حتى المضيفة مستعدة للزرع

2. إعداد المضيف

1. تعرض الجنين
   1. باستخدام الحقنة 10 مل و إبرة قياس 18 مل من 1.0 إزالة الزلال من نهاية وأشار من قشرة البيضة.
   2. جعل ثقب صغير في الجزء العلوي من الغلاف باستخدام مقص نقطة. ضع قطعة من الشريط فوق الحفرة ، وقطع دائرية ثم فتح للكشف عن الجنين.
2. 2 به زوجا من الملقط ، فهم السلى وبلطف المسيل للدموع لإحداث الثقب.
3. استدارة الرأس بوضع زوج من ملقط على العين اليمنى والضغط. في حين عقد رئيس مطرد ، واستخدام إبرة لإزالة التنغستن الأديم الظاهر المضيف لاستيعاب الكسب غير المشروع.
4. نقل الكسب غير المشروع إلى المضيف باستخدام ماصة الزجاج.
5. موقف الكسب غير المشروع لتحل محل الأديم الظاهر إزالتها. اضافة الى وجود دبوس الزجاج في كل زاوية من النسيج المطعمة يعلقون الكسب غير المشروع في المكان. دبابيس لجعل الزجاج ، وسحب أنبوب microcapillary إلى نقطة غرامة على مدى اللهب الكحول.
6. مكان الشريط بإحكام خلال ثقب والعودة الجنين الى حاضنة لمدة مناسبة من الوقت لتحليلها.
7. انظر أيضا : ⁹

3. ممثل النتائج :

لتقييم الوهم ، ينبغي جمع الأجنة ومعالجتها لتحليل توزيع المضيفة والمانحة الأنسجة. للكشف عن خلايا السمان ، المناعية باستخدام أجسام مضادة QcPN (الموصوفة في : ³⁾ يعمل ، وللكشف عن خلايا فأر في التهجين الموقع على أقسام البارافين يستخدم ^6. وينبغي أن يقتصر الخلايا المانحة للظهارة ، وينبغي أن يكون هناك أي دليل على أنسجة المانحة الوسيطة (الشكل 1). وجود خلايا المانحة المعزولة في اللحمة المتوسطة يدل على وجود الخلايا العصبية التي تلوث قمة سوف نخلط أي تفسير الشكلية نظرا لتأثير هذه الخلايا على العديد من جوانب التنمية الوجه (على سبيل المثال ، ^10). مرة واحدة على اقتناع بأن تقنية خالية من الكسب غير المشروع هو تلويث اللحمة المتوسطة ، ويمكن استخدام مزيد من التدابير نتائج المورفولوجية أو الجزيئي لتقييم الوهم. لأغراضنا ، اكتشفنا وجود حمل خارج الرحم الغضاريف والعظام التي تتوافق مع الازدواجية في الفك العلوي التي يسببها الأنسجة المزروعة (الشكل 2) ، والتغيرات الجزيئية في الأنسجة الوسيطة ردا على المطعمة الأديم الظاهر (الشكل 3) ^5،6.

الشكل 1. تقييم الخيمرية يستخدم (أ) مكافحة QcPN تلوين للكشف عن خلايا في السمان السمان ، فرخ الوهم. لا يوجد أي دليل على تلطيخ في اللحمة المتوسطة. يستخدم (B) في الموقع التهجين للكشف عن التعبير النصوص B2 شرط في الماوس الفرخ الوهم. ويقتصر التعبير على الأديم الظاهر تضم الكسب غير المشروع.

الشكل 2. تلوين ثلاثي الألوان يظهر ازدواجية هيكل عظمي الفك العلوي في خيمر السمان ، الفرخ (A) و (B) الوهم الماوس الفرخ.

الشكل 3 ، والأديم الظاهر regultes التعبير الجيني في اللحمة المتوسطة. (أ) عادي Bmp7 التعبير في اللحمة المتوسطة من جنين الفرخ (المشعة في الموقع التهجين مع الإيجابية الزائفة أحمر اللون في إشارة أدوبي فوتوشوب). (ب) هي التي يسببها Bmp7 التعبير في اللحمة المتوسطة المتاخمة للطعم (السهم) في أجنة خيالية.

Discussion

باستخدام هذا الأسلوب زرع سمح لنا لتحديد الأديم الظاهر أن يحتوي على معلومات يشير إلى أن ينظم قطبية ظهري بطني والإرشاد proximodistal من الفك العلوي. التشابه في النتائج عند استخدام الماوس السمان أو الأديم الظاهر ، والحفاظ على الاشارات الجزيئية في هذا النسيج من بين العديد من ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Tektronix, Inc.	TEKZR114
DMEM	University of California - San Francisco	CCFDA003
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Dispase	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
35x10 mm Petri dish	Falcon BD	1008
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Spring Scissors	Fine Science Tools	15010-11
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000
Microcapillary tube	Drummond Scientific	3-000-225-G
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-6B
Spring scissors	Fine Science Tools	15010-11
Blade holder	Fine Science Tools	10052-11
Razor blade	Fine Science Tools	10050-00