Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

Özet

Bu makale, kraniyofasiyal gelişimi sırasında sinyalizasyon ve yüzey sefalik ektoderm desenlendirme özellikleri test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği açıklar.

Özet

Erişilebilirlik kuş embriyoların deneysel embriyologlar kalkınma ve desenlendirme ve omurgalıların morfolojilerinden (örneğin, ^{1, 2, 3, 4)} düzenleyen doku etkileşimleri rol sırasında hücre kaderi anlamaya yardımcı olmuştur. Burada, yüz gelişimi sırasında ektodermal dokuların sinyalizasyon ve desenlendirme özelliklerini test etmek için bu erişilebilirlik yararlanan bir yöntem göstermektedir. Bu deneylerde, aynı bölgede ya da bir civciv embriyo ektopik bölge üzerine, bıldırcın ya da fare üst çene kapsayan yüzey sefalik ektoderm nakli ^{bıldırcın-chick} 5 veya ^fare civciv 6 kimeralar oluşturmak. Civciv içine nakli için donör doku olarak bıldırcın kullanımı, böylece araştırmacılar host ve donör ^dokuları 7 ayırt etmek için izin, bıldırcın içinde mevcut değil civciv hücreleri nucleolar marker yararlanmak için geliştirilmiştir . Aynı şekilde, bize fare civciv kuruntulardan ⁸ host ve donör dokuları ayırt etmek için izin verir, tekrarlayan bir unsur fare genomunda mevcut ve yayg ifade edilir. Bu bize çeşitli mutant embriyolardan elde edilen ektoderm sinyalizasyon özellikleri test etmek için izin verecek, çünkü donör doku olarak fare ektoderm kullanımı büyük ölçüde, bu doku etkileşimleri anlayışımızı uzatacaktır.

Protokol

1. Donör Doku hazırlanması

1. Kültür ortamı hazırlayın, cam pimleri keskinleştirmek, tungsten iğneler keskinleştirmek.
2. Kabuk embriyonun toplayın, buz gibi soğuk PBS içinde yıkayın.
   1. 10 ml şırınga ve 18 gauge iğne ile yumurta kabuğu sivri ucundan 1.0 mL albumin çıkarın.
   2. Makas noktasını kullanarak kabuğun üstünde küçük bir delik açın ve sonra embriyo maruz dairesel bir açılış kesip
3. DMEM (serum serbest, oda sıcaklığı), baş ve yer çıkarın
4. Embriyo Frontonasal Süreci teşrih (veya maksiller ve mandibular süreci gibi diğer donör sitesi)
5. 20mins için buz üzerinde PBS içinde 2.4U / ml dispase Digest
6. Sindirim durdurmak için% 1 BSA DMEM birlikte dokularda Kapak
7. Ayrı ektoderm, mezenşimin ve neuroectoderm bilenmiş tungsten iğne kullanın.
8. Host nakli için hazır olana kadar buz üzerinde DMEM% 1 BSA greft doku Mağaza

2. Host hazırlanması

1. Embriyo Açığa
   1. 10 ml şırınga ve 18 gauge iğne ile yumurta kabuğu sivri ucundan 1.0 mL albumin çıkarın.
   2. Makas noktasını kullanarak kabuğun üstünde küçük bir delik açın. Delik üzerine bir parça bant yerleştirin ve sonra embriyonun maruz dairesel bir açılış kesmek.
2. 2 çift forseps kullanarak, amniyon kavrayın ve yavaşça bir delik yapmak için gözyaşı.
3. Sağ göz forseps bir çift yerleştirerek ve basınç uygulayarak baş döndürün. Kafa sabit tutarken, greft yerleştirmek için ev sahibi ektoderm kaldırmak için bir tungsten iğne kullanınız.
4. Cam bir pipet kullanarak ana greft aktarın.
5. Greft kaldırılan ektoderm yerine yerleştirin. Greft pin aşılı doku her köşesinde bir cam pimi takın. Cam pimleri yapmak için, alkol ateşte ince bir nokta microcapillary tüp çekin.
6. Delik üzerinde sıkı bir bant yerleştirin ve analiz için zaman uygun uzunluğu için inkübatör embriyo geri.
7. ayrıca bkz: ⁹

3. Temsilcisi Sonuçlar:

Kimeralar değerlendirmek için, embriyolar toplanan ve ev sahibi ve donör dokuları dağılımı analizi için işlenmiş olmalıdır. QcPN antikor kullanarak bıldırcın hücreleri, immünhistokimya tespiti için (açıklandığı: ³⁾ istihdam ve fare hücreleri algılama, kesitler in situ hibridizasyon için ⁶ kullanılır. Donör hücreleri epitel sınırlı olmalı ve donör mezenkimal dokuların herhangi bir kanıt olması gerekir (Şekil 1). Mezenşimin izole donör hücrelerinin varlığı yüz geliştirme (örneğin, ¹⁰⁾ pek çok açıdan bu hücrelerin etkisi nedeniyle herhangi bir morfolojik yorumlanması bulandırabilir kirlenme nöral krest hücrelerinin varlığını gösterir. Bir kez ikna greft tekniği mezenşimin kirlenmesine neden olduğunu ileri morfolojik veya moleküler sonuç ölçümleri, kuruntulardan değerlendirmek için kullanılabilir. Bizim amaçlarımız için, üst çene (Şekil 3) (Şekil 2) aşılı ektoderm yanıt nakledilen dokuları ve mezenkimal dokuların moleküler değişiklikler ile indüklenen mükerrer denk ektopik kıkırdak ve kemiklerin varlığı tespit ^5,6.

Şekil 1. Kimerizm Değerlendirmesi (A) Anti-QcPN boyama, bıldırcın civciv kimeralar bıldırcın hücreleri algılamak için kullanılır . Mezenşimin boyanma hiçbir kanıt yoktur. (B) in situ hibridizasyon fare civciv kimeralar SINE B2 transkript ifade algılamak için kullanılır. İfade greft oluşan ektoderm sınırlıdır.

Şekil 2 trikrom boyama, (A) bıldırcın-chick chimera üst çene iskelet çoğaltılması ve (B) fare ve civciv kimeralar gösterir.

Şekil 3 ektoderm mezenşimin gen ekspresyonu regultes. (A) Normal bir civciv embriyo mezenşimin Bmp7 ifade (Adobe Photoshop olumlu sinyal pseudo-kırmızı boyalı in situ hibridizasyon radyoaktif). (B) Bmp7 ifade kimerik embriyolar greft (Ok) bitişik mezenşimin indüklenir.

Tartışmalar

Bu nakli yöntemi kullanarak bize ektoderm dorsoventral polarite ve üst çene proximodistal uzatma düzenleyen sinyal bilgisini içerdiğini belirlemek için izin verdi. Bıldırcın veya fare ektoderm, ve birçok türün ^6,11 arasında bu doku moleküler sinyaller korunması kullanarak sonuçların benzerlik omurgalıların hiçbirinde görülmeyen, son derece korunmuş bir sinyalizasyon merkezi olduğunu gösterir . Ayrıca, diğer araştırmacılar, farklı bölgelerin yüzey sefalik ektoderm sinyalizasyo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Tektronix, Inc.	TEKZR114
DMEM	University of California - San Francisco	CCFDA003
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Dispase	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
35x10 mm Petri dish	Falcon BD	1008
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Spring Scissors	Fine Science Tools	15010-11
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000
Microcapillary tube	Drummond Scientific	3-000-225-G
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-6B
Spring scissors	Fine Science Tools	15010-11
Blade holder	Fine Science Tools	10052-11
Razor blade	Fine Science Tools	10050-00