Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

Resumo

Este artigo descreve uma técnica de transplante de tecido que foi projetado para testar a sinalização e padronização das propriedades ectoderma de superfície cefálica durante o desenvolvimento craniofacial.

Resumo

A acessibilidade dos embriões aviária ajudou embriologistas experimental entender o destino das células durante o desenvolvimento eo papel das interações tecido que regulam padronização e morfogênese de vertebrados (eg, ^{1, 2, 3, 4).} Aqui, nós ilustrar um método que explora essa acessibilidade para testar a sinalização e as propriedades padrões dos tecidos durante o desenvolvimento ectodérmico facial. Nesses experimentos, nós criamos codornas-chick ⁵ ou ⁶ do mouse grão-de-quimeras transplantando o ectoderma cefálica que cobre a mandíbula superior de codorniz ou o mouse para qualquer região do mesmo ou uma região ectópica de embriões de galinha. O uso de codorna como tecido do doador para o transplante em pintos foi desenvolvido para tirar vantagem de um marcador nucleolar presente em codornas mas não células de bico, permitindo assim que os pesquisadores a distinguir host e tecidos de doadores ^7. Da mesma forma, um elemento repetitivo está presente no genoma do rato e é expressa ubiquitously, que nos permite distinguir host e tecidos de doadores em grão-de-rato quimeras ^8. O uso de ectoderma mouse como tecido do doador será extremamente estender nossa compreensão dessas interações tecido, porque isso irá permitir-nos testar as propriedades de sinalização do ectoderma derivado de vários embriões mutantes.

Protocolo

1. Preparar o tecido do doador

1. Prepare meios de cultura, sharpen pinos de vidro, afiar agulhas de tungstênio.
2. Coletar embriões a partir de casca, lavar em PBS gelado.
   1. Usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18 remover 1,0 mL de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo.
   2. Faça um pequeno furo na parte superior do escudo usando o ponto de tesouras, e depois cortar uma abertura circular para expor o embrião
3. Retire a cabeça e coloque em DMEM (soro livre, temperatura ambiente)
4. Dissecar processo frontonasal do embrião (ou o site de outros doadores, como processo maxilar ou mandibular)
5. Digest em 2.4U / mL em PBS dispase em gelo por 20 minutos
6. Cobrir tecidos com DMEM com BSA 1% para parar a digestão
7. Use agulha de tungstênio afiadas para ectoderma separado, mesênquima, e neuroectoderma
8. Loja de tecidos do enxerto em DMEM BSA 1% em gelo até anfitrião está pronto para transplante

2. Preparando o Host

1. Expor o embrião
   1. Usando uma seringa de 10 ml e uma agulha de calibre 18 remover 1,0 mL de albumina da extremidade pontiaguda da casca do ovo.
   2. Faça um pequeno furo na parte superior do escudo usando o ponto de tesouras. Coloque um pedaço de fita adesiva sobre o furo, e depois cortar uma abertura circular para expor o embrião.
2. Usando dois pares de fórceps, segure o âmnio e gentilmente lacrimogêneo para fazer um buraco.
3. Gire a cabeça, colocando um par de fórceps no olho direito e aplicar pressão. Enquanto segura a cabeça firme, use uma agulha de tungstênio para remover o ectoderma host para acomodar o enxerto.
4. Transferência do enxerto ao hospedeiro, utilizando uma pipeta de vidro.
5. Posição do enxerto para substituir o ectoderma removido. Insira um alfinete de vidro em cada canto do tecido enxertado para fixar o enxerto no local. Para fazer com que os pinos de vidro, puxe um tubo microcapilar a um ponto fino sobre uma chama de álcool.
6. Coloque fita firmemente em cima do buraco e voltar embrião para a incubadora para o comprimento de tempo adequado para análise.
7. veja também: ⁹

3. Resultados representativos:

Para avaliar quimeras, os embriões devem ser coletadas e processadas para análise da distribuição de host e tecidos de doadores. Para a detecção de células de codorna, imunohistoquímica utilizando o anticorpo QcPN (descrito em: ³⁾ é empregado, e para a detecção de células de camundongo, hibridização in situ em cortes de parafina é usada ^6. Células do doador deve ser restrito ao epitélio, e não deve haver nenhuma evidência de tecidos de doadores mesenquimais (Figura 1). A presença de células do doador isolado no mesênquima indica a presença de células da crista neural contaminação que irá confundir qualquer interpretação morfológica devido à influência dessas células em muitos aspectos do desenvolvimento facial (por exemplo, ^10). Uma vez convencidos de que a técnica de enxerto é livre de contaminação mesênquima, medidas de resultados ainda morfológicas ou moleculares podem ser utilizados para avaliar as quimeras. Para nossos propósitos, que detectou a presença de cartilagens e ossos ectópica que correspondeu a duplicação da mandíbula superior, que foram induzidos pelos tecidos transplantados (Figura 2), e alterações moleculares nos tecidos mesenquimais, em resposta ao ectoderma enxertado (Figura 3) ^5,6.

Figura 1. Avaliação do quimerismo (A) coloração Anti-QcPN é usado para detectar células de codorna em codorna-chick quimeras. Não há nenhuma evidência de coloração no mesênquima. (B) A hibridização in situ é usado para detectar a expressão de transcritos SINE B2 em grão-de-rato quimeras. Expressão é restrita ao ectoderma que compõem o enxerto.

Figura 2. Coloração Tricrômico mostra a duplicação do esqueleto maxilar superior em (A) de codorna-chick quimera, e (B) do mouse grão-de-quimeras.

Figura 3. O ectoderma regultes expressão gênica no mesênquima. (A) expressão Bmp7 normal no mesênquima de um embrião de galinha (radioativo hibridização in situ com o positivo sinal vermelho pseudo-colorido no Adobe Photoshop). (B) expressão Bmp7 é induzida no mesênquima adjacente ao enxerto (Seta) em embriões quiméricos.

Discussão

Usando este método de transplante nos permitiu determinar que o ectoderma contém informações de sinalização que regula a polaridade dorsoventral e extensão proximodistal do maxilar superior. A similaridade de resultados quando se utiliza codorniz ou ectoderma mouse, ea conservação dos sinais moleculares neste tecido entre muitas espécies ^6,11 indica que este é um centro altamente conservada entre os vertebrados de sinalização. Além disso, outros pesquisadores usaram técnicas semelhantes para te...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Tektronix, Inc.	TEKZR114
DMEM	University of California - San Francisco	CCFDA003
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Dispase	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
35x10 mm Petri dish	Falcon BD	1008
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Spring Scissors	Fine Science Tools	15010-11
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000
Microcapillary tube	Drummond Scientific	3-000-225-G
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-6B
Spring scissors	Fine Science Tools	15010-11
Blade holder	Fine Science Tools	10052-11
Razor blade	Fine Science Tools	10050-00