طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Summary

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم. العدلات التي تمتلك وظائف ينظم transcriptionally مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. يمكن دراسة هذه الوظائف مع أسلوب المعروضة هنا، والذي يسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى التدفق الخلوي معزولة

Abstract

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي. هذه الخلايا هي الأولى في الظهور في مواضع الالتهابات والعدوى، وبذلك أصبحت خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. العدلات المضادة للجراثيم التي تمتلك وظائف هامة مثل البلعمة، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. وبالإضافة إلى هذه المهام مهمة الدفاع، العدلات أداء مهام أخرى في الاستجابة للإصابة مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. السيتوكينات تجنيد الكريات البيض الأخرى التي تساعد مسح العدوى، وتثبيط الخلايا العدلة يسمح للعيش لفترة أطول في موقع العدوى. وينظم هذه الوظائف على مستوى النسخ. ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا أن يؤديها مع الطرق التقليدية الجينات مراسل حيث لا توجد ايفيآاف لتقنيات ترنسفكأيشن العدلات. هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات نقية من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا المضادة للمستقبلات الأجسام المضادة، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى. وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-كيلوبايت وإلك-1 العوامل النووية في نوى من العدلات وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل خيارا لتحليل تفعيل عوامل النسخ في النواة معزولة من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

Introduction

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي ^1. العدلات خلال الالتهاب والعدوى هي الخلايا الأولى لتظهر في موقع المتضررة حيث يكون بمثابة خط الدفاع الأول ^2. العدلات تمتلك آليات عدة مضادات الميكروبات ³ بما البلعمة، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي بواسطة تحبب، وإنتاج السيتوكينات proinflammatory ^4،5. العدلات هي خلايا قصيرة الأجل التي تحصل بسرعة من خلال تفعيل الإشارات من مختلف مستقبلات سطح الخلية. وعلى الرغم من اعتبار العدلات الخلايا الطرفية بسبب حياتهم القصيرة والخضوع لأنهم موت الخلايا المبرمج إلا إذا تفعيلها خلال عملية الالتهاب ^6، فمن الواضح الآن أن يتمكنوا من تعديل النمط الظاهري أيضا عن طريق تغيير مستوى النسخ جينات معينة. إنتاج السيتوكينات ⁽⁵⁾ وتثبيط الخلايا نوعان من ^7،8 طmportant وظائف الخلية التي تعتمد على تفعيل تنظيم على مستوى النسخ في العدلات. النووية كيلوبايت عامل (NF-كيلوبايت) تشارك في السيطرة النسخي من ⁴ وإنتاج السيتوكينات في تنظيم بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج في ^9-11 أنواع الخلايا المختلفة.

يتم دراسة مسارات الإشارات عادة التي تؤدي إلى تنشيط العامل النووي من الجينات مراسل المقايسات أو عن طريق فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA). ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا يتم تنفيذ المقايسات مع الجينات مراسل، حيث لا توجد تقنيات فعالة لترنسفكأيشن العدلات. وقد استخدمت المقايسات EMSA في العدلات لاستكشاف النووية تفعيل عامل ^12،13، ولكن هذه المنهجية هي معقدة ومكلفة لأنه ينطوي على استخدام المواد المشعة. Nucleofection هو أسلوب آخر التي استخدمت ناجحهLLY لبالنقل حيدات ^14. وهكذا، على الأقل من الناحية النظرية، يمكن أن الكشف عن تفعيل النووية عامل في العدلات من ترنسفكأيشن (على الرغم من انخفاض الكفاءة). ومع ذلك، فإن هذه التقنية أن تكون أكثر تكلفة، تستغرق وقتا طويلا وربما أقل كمية. ويمكن أيضا تحليل مجهري للخلايا immunostained أن تستخدم لكشف العوامل النووية في النواة. في الواقع، لقد اكتشفنا NF-كيلوبايت إزفاء إلى النواة بهذه الطريقة ^15. للأسف، هذا الأسلوب هو أيضا تستغرق وقتا طويلا، كمية أقل، وتخضع للانحياز المراقب.

هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا عن طريق integrins أو مستقبلات التيسير مع مستقبلات الأجسام المضادة المضادة لل، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى (Figure 1). وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن ^NF-15 و إلك كيلوبايت-1 ¹⁶ العوامل النووية في نوى العدلات. حساسية هذا الأسلوب يسمح الكشف عن التغيرات الصغيرة في مستويات عامل النووي في النواة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل مستوى عوامل النسخ في النواة من أنواع الخلايا الأخرى.

Protocol

1. عزل العدلات (السوداء) من دم الإنسان

1. استخدام حوالي 20 مل دم الإنسان مع الهيبارين (10 U / مل)، وتخثر. وقد تم جمع الدم من المتطوعين الأصحاء البالغين من venopuncture. وقد أجريت جميع التجارب في إطار موافقة لجنة الأخلاقيات البيولوجية في معهد لأبحاث Biomédicas دي - UNAM.
2. وضع 2 مل من T500 ديكستران 6٪ في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل المخروطية الطرد المركزي وإضافة 10 مل من الدم. مزيج من أنبوب للقلب مرتين أو ثلاث مرات، والسماح لها الجلوس لمدة 45 دقيقة للسماح للترسيب كريات الدم الحمراء.
3. في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة المخروطية وضع 5 مل Ficoll-Paque.
4. تأخذ البلازما الغنية الكريات البيض التي شكلت كرات الدم الحمراء أعلاه sedimented، وماصة بعناية على أعلى من Paque-Ficoll تشكيل طبقة ثانية. تأكد من عدم ومرحلتين.
5. أجهزة الطرد المركزي في 516 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 بعد الطرد المركزي، في الطور البيني من البلازما وFicoll Paque-هناك طبقة من الخلايا وحيدات النوى. شمال شرقutrophils هي في الجزء السفلي من الأنبوب.
6. القضاء طاف، كسر بيليه الخلية من خلال الاستفادة من أنبوب ضد الرف، و resuspend الخلايا بإضافة 10 مل من البرد (4 ° C) PBS ملاحظة: Resuspending الخلايا عن طريق pipetting صعودا ونزولا غير مستحسن لأن هذا هو أيضا تضر الخلايا.
7. نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب 50 مل المخروطية الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الى 290 XG لمدة 5 دقائق في C. ° 4
8. كسر بيليه الخلية كما في السابق وإضافة 10 مل من البرد (4 ° C) حل ناقص التوتر (0.2٪ كلوريد الصوديوم، 1٪ BSA، و 20 ملي Hepes، ودرجة الحموضة = 7.4) لكرات الدم الحمراء ليز. مزيج من دوامات الأنبوب بلطف باليد لدقيقة واحدة بالضبط.
9. إضافة 10 مل من البرد (4 ° C) حل مفرط التوتر (1.6٪ كلوريد الصوديوم، 1٪ BSA، و 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.4)، ومزيج عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (عادة> 95٪ هي PMN).
   ملاحظة: حافظ على أنبوب مع التعليق الخلية على الجليد بينما عد الخلايا.
10. أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل و resuspend في 10 PMN7 خلية / مل في البرد (4 ° C) PBS. تبقي على الجليد.
    ملاحظة: العدلات تبقى قابلة للحياة وظيفية في 4 درجات مئوية لمدة حوالي 6 إلى 8 ساعات.

2. تفعيل PMN

1. وضع 100 ميكرولتر من التعليق PMN (1 × 10 ⁷ خلية / مل) في أنبوب إيبندورف 1،5 مل.
   ملاحظة: يجب أن يتم أنابيب العينات على الأقل في التكرارات. يجب أن تشمل الضوابط السلبية المعتادة الضد الأول فقط، والأجسام المضادة الثانوية فقط.
2. إضافة الأجسام المضادة مستقبلات المقابلة المضادة للإنتغرين أو المضادة وحيدة النسيلة FC-(ماب) في 10 ميكروغرام / مل واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
3. غسل PMN بإضافة 1 مل من البرد (4 ° C) PBS، الطرد المركزي في 1743 x ج (4،500 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج، وطاف الشفط.
4. كسر بيليه الخلية من خلال استغلال الجزء السفلي من أنبوب ضد الرف، إضافة 1 مل PBS الباردة، ويغسل مرتين أخريين كما في الخطوة السابقة.
   ملاحظة: هذه الأجسام المضادة يغسل إزالة غير منضم.
5. إعادة تعليق PMN في نفسه (فيitial) حجم الدافئة (37 ° C) PBS تحتوي على 60 ميكروغرام / مل من F ('AB) 2 الماعز المضادة للمفتش الماوس.
   ملاحظة: إن الأجسام المضادة الثانوية مفتش مكافحة الماوس سوف ربط الأجسام المضادة المضادة للمستقبلات الأولى وسوف يسبب يشابك من مستقبلات.
6. احتضان في C ° 37 لمدة 1 20 دقيقة، اعتمادا على عامل النووية المثيرة للاهتمام. لNF-كيلوبايت 15 دقيقة عادة، وعادة ما إلك-1 5 دقائق.
   ملاحظة: احتضان الخلايا في 37 درجة C يحفز مستقبلات يشابك، والتي لا يمكن أن يتم في 4 درجات مئوية.
7. إضافة 1 مل PBS الباردة وأجهزة الطرد المركزي 3 دقائق في 1743 XG في ميكروسنتريفوج.
8. إزالة طاف
9. تجميد PMN فورا في حمام dry-ice/ethanol والاحتفاظ بها هناك لمدة 10 دقيقة.

3. العزلة وتثبيت نوى

1. إعادة تعليق بيليه PMN المجمدة في 100 ميكرولتر الباردة (4 ° C) ناقص التوتر العازلة (HEPES 10 مم، 10 ملي بوكل، 1.5 ملم MgCl _2، و 1 ملم المضافة حديثا _{DL-dithiothreitol} [DTT]؛ درجة الحموضة = 7.9). فمن المستحسن أن تتخذ أنابيب من حمام dry-ice/ethanol واحدا تلو الآخر، وامسحي الجزء السفلي من الأنبوب قبل إضافة العازلة ناقص التوتر.
2. مكان على الجليد، والتحقق من سلامتها من تلطيخ نواة لقسامة من التعليق نوى مع الأزرق التريبان. نوى تبدو مستديرة والأزرق. لا PMN سليمة الحصول على الملون، والحطام الخلية يظهر الجسيمات الزرقاء شكل غير منتظم.
   ملاحظة: إذا نوى التعليق يحتوي على خلايا سليمة أو العديد من الحطام، فمن الأفضل لتجاهل إعداد وكرر الإجراء مع عينة أخرى.
3. أجهزة الطرد المركزي في نوى XG 775 (3،000 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج لمدة 10 دقيقة داخل غرفة باردة. في هذه المرحلة هي نواة ينبغي الحرص هشة للغاية وغير في الحفاظ على عينات الباردة وليس الطرد المركزي في قوات المفرطة.
4. إزالة طاف بواسطة pipetting حذرين للغاية.
5. إضافة 100 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لإصلاح النوى.
   ملاحظة: بيليه هو فضفاض جدا علىد مضيفا المخزن المؤقت يكفي ل resuspend نواة. وينبغي تجنب pipetting صعودا وهبوطا.
6. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
7. Immunolabel نواة لالتدفق الخلوي أو الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى 24 ساعة في 4 درجات مئوية.

4. Immunolabeling نواة لتحليل قياس التدفق الخلوي

1. أجهزة الطرد المركزي في 1743 x ج النوى (4،500 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف بواسطة pipetting لطيف جدا.
2. إضافة 100 ميكرولتر من البرد (4 ° C) 0.1٪ تريتون X-100، بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لpermeabilize نوى. احتضان في الثلج لمدة 10 دقيقة.
3. أجهزة الطرد المركزي في 1743 نوى permeabilized XG في ميكروسنتريفوج وإزالة بعناية طاف. في هذه المرحلة نواة الكريات لا نعلق جيدا في الجزء السفلي من الأنبوب. فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إذا كان بيليه يحصل فضفاضة.
4. إعادة تعليق نوى في 500 ميكرولتر من الدم البارد الجنين 4٪ البقري (FBS) في برنامج تلفزيوني لحجب المواقع غير محدد ملزم، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. نبذنوى في 1743 x ج لمدة 3 دقائق في ميكروسنتريفوج وإزالة بعناية طاف.
5. إعادة تعليق نوى في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على 4٪ FBS و 2.5 ميكروغرام / مل من ماب ضد العامل النووي في المصالح. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: يجب أن تشمل الضوابط السلبية المعتادة المناهضة للاسلحة النووية الأجسام المضادة العامل الوحيد، والتي تحمل علامات فقط FITC الضد الثانوية.
6. يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 4٪ والطرد المركزي في 1743 x ج لمدة 3 دقائق.
7. إزالة طاف بعناية فائقة، نوى resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على 4٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة التي تحمل علامات المقابلة FITC الثانوية، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
8. يغسل مرتين مع 500 نواة ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 4٪ كما في الخطوة السابقة.
9. إعادة تعليق نوى في 400 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني.
   يتم وضع النواة في بارافورمالدهيد للسماح ليتم تخزينها العينة لعدة أيام دون تلوث: مذكرةالمشاكل التي يمكن أن تحدث في وجود المصل.
10. تحليل التدفق الخلوي مباشرة أو تخزينها في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام.

5. تدفق الخلوي تحليل

1. تحليل نوى immunolabeled في قياس التدفق الخلوي مثل هذا FACScan (بيكتون ديكنسون، فرانكلين البحيرات، NJ) أجهزة أو ما شابه ذلك.
2. ضبط إعدادات اقتناء إلى: FSC في النطاق سجل في 10-1، SSC في النطاق سجل في 196، ونوى بوابة في مؤامرة دوت.
3. الحصول على 10000 نواة لكل عينة.
4. تحليل مضان FITC من الملطخة نوى من خلال قناة FL-1 (506 نانومتر) وضعت في النطاق سجل في 400.

النتائج

طريقة تنقية صفها هنا عادة ما يوفر العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (الشكل 1A). ويمكن بعد ذلك أن PMN معزولة يحفزه مستقبلات خاصة يشابك مع الاجسام المضادة المحددة. حفزت مستقبلات نحن PMN من خلال التيسير وintegrins (1B الشكل). حفز مرة واحدة، وهي lysed PMN ويتم ?...

Discussion

طريقة تنقية صفها هنا يسمح للعزل العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (عن طريق الملاحظة المجهرية المقررة)، في وقت قصير. يمكن في بعض الأحيان أن تكون ملوثة من قبل العدلات الكريات الحمراء إذا لم يتم هذا الأخير هي lysed تماما. هذا لا يؤثر عادة هذه التقنية، يمكن بسهولة من...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur