フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

要約

好中球は、血液中に最も豊富に存在する白血球である。好中球は、このような炎症性サイトカインとアポトーシスの抑制​​の生産などの転写調節機能を有する。これらの関数は、単離核で、フローサイトメトリーによって核内因子の検出および定量化を可能にするここに示す方法で研究することができる

要約

好中球は、末梢血中に最も豊富に存在する白血球である。これらの細胞は、このように微生物を侵略に対する最初の防衛線となって、炎症や感染部位に最初に表示されています。好中球は、貪食作用、溶菌酵素の放出、活性酸素種の産生などの重要な抗菌機能を有する。これらの重要な防御機能に加えて、好中球などの炎症性サイトカインおよびアポトーシスの阻害の生産などの感染症に対応して他のタスクを実行します。サイトカインは、感染をクリアに役立つ他の白血球をリクルートする、アポトーシスの阻害は、好中球が感染部位で長生きすることができます。これらの機能は、転写レベルで調節されている。好中球は短命の細胞であるため、全く効率が存在しないためしかし、これらの細胞における転写調節応答の研究は、従来のレポーター遺伝子のメソッドで実行することはできません好中球のトランスフェクションのためcientテクニック。ここでは、フローサイトメトリーによって単離し、免疫標識核における核内因子の検出および定量化を可能にするシンプルで効率的な方法を提示する。我々は、ヒト末梢血から純粋な好中球を分離するための手法について説明抗受容体抗体で、これらの細胞を刺激し、隔離し、immunolabel核、フローサイトメトリーで核を分析します。メソッドが成功した好中球および他の細胞型から核内にNF-κBおよびエルク-1核内因子を検出するために使用されています。したがって、この方法では、種々の細胞型から単離核内転写因子の活性を分析するためのオプションを表します。

概要

好中球は末梢血¹に最も豊富に存在する白血球である。炎症や感染症、好中球の間に、彼らは防衛²の最初の行として働く場所患部に出現する最初の細胞である。好中球は貪食作用、活性酸素種の産生、脱顆粒によって溶菌酵素の放出、および^{4,5 -}炎症性サイトカインの産生を含むいくつかの抗菌メカニズムの^3を所有^{しています} 。好中球は急速に様々な細胞表面の受容体からのシグナル伝達を介して活性化取得短命な細胞である。好中球は、その短い寿命のため、端末の細胞と考えられ、炎症過程⁶の間に活性化されない限り、彼らはアポトーシスを受けるので、それは、彼らはまた、特定の遺伝子の転写のレベルを変更することにより、それらの表現を変更できることが明らかになってきたが。サイトカイン⁵と^7,8アポトーシスの阻害の生産は、i 2アール好中球の転写レベルで調節mportant活性化に依存した細胞機能。核因子κB（NF-κB）は、サイトカイン産生⁴の転写制御で、様々な種類の細胞における細胞生存とアポトーシス^9-11の調節に関与している。

核因子の活性化につながるシグナル伝達経路は、通常、レポーター遺伝子アッセイにより、または電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって研究されている。好中球は短命の細胞であるため、好中球のトランスフェクションのための効率的な技術が存在しないためしかし、これらの細胞における転写調節応答の研究は、レポーター遺伝子アッセイを使用して実行することはできません。 EMSAのアッセイは、核因子活性化^12,13を探索するために好中球に使用されてきたが、それが放射性物質の使用を伴うので、しかしながら、この方法論は、複雑で高価である。クレオはsuccessfu使用されています別の技術であるLLY単球^14をトランスフェクトする。したがって、少なくとも理論的には、核因子の活性化は、トランスフェクションによる好中球（低効率にもかかわらず）で検出することができた。しかし、この技術は、時間がかかり、おそらく少ない定量より高価になるだろう。免疫染色された細胞の顕微鏡分析はまた、核内で核内因子を検出するために使用することができる。実際、我々は核 ​​こうして¹⁵にNF-κBの転座を検出した。残念なことに、この手法はまた、時間のかかるレス定量的、かつ観察者バイアスの影響を受けます。

ここでは、フローサイトメトリーによって単離し、免疫標識核における核内因子の検出および定量化を可能にするシンプルで効率的な方法を提示する。我々は、F（フローサイトメトリーにより、ヒト末梢血から好中球を分離抗受容体抗体とインテグリンまたはFc受容体を介して、これらの細胞を刺激し、隔離し、immunolabel核を、核を分析するための手法について説明igure 1）。メソッドが成功し^、NF-κB15および好中球の核内エルク-1 ¹⁶核内因子を検出するために使用されています。この方法の感度は、核内の核因子レベルの小さな変化を検出することができます。また、この方法は、他の細胞型から核内転写因子のレベルを分析するために使用することができます。

プロトコル

1。ヒトの血液から好中球の分離（PMN）

1. 抗凝固剤としてヘパリン（10 U / ml）で約20mlヒトの血液を使用します。血液はvenopunctureによって成人の健康なボランティアから採取した。 UNAM - 全ての実験は、のInstituto de InvestigacionesBiomédicasにおける生命倫理委員会の承認の下で行われた。
2. 15mlコニカル遠心チューブにPBSで6％デキストランT500の2ミリリットルを入れて、血液の10ミリリットルを追加します。チューブを反転することによって2倍または3倍を混ぜて、それが赤血球沈降を可能にするために45分間放置します。
3. 新鮮な15mlコニカル遠心管に5ミリリットルのFicoll-Paqueは置く。
4. 赤血球沈降の上方に形成された白血球血小板血漿を取り、慎重に第2層を形成するのFicoll-Paqueの上に移します。 2フェーズがあることを確認してください。
5. 4℃で20分間、516×gで遠心分離し、遠心分離後、血漿とのFicoll-Paqueの相間での単核細胞の層がある。ねーutrophilsは、チューブの下部にあります。
6. 上清を取り除き、ラックに対してチューブをタップして、細胞ペレットを壊し、風邪の10ミリリットル（4℃）、PBS（注）追加することで、細胞を再懸濁する。ピペッティングにより細胞を再懸濁し、これがあまりにもあるのでダウンはお勧めしませんが細胞にダメージを与える。
7. 4℃で5分間、290×gで50ミリリットルコニカル遠心チューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移す
8. 前と同じように細胞ペレットを破ると冷たい（4℃）赤血球を溶解するために低張液（0.2％のNaCl、1％BSA、20mMのHEPES、pH = 7.4）中の10 mlを加える。正確に1分間手で優しくチューブを回して混ぜる。
9. 冷（4℃）高張液（1.6％のNaCl、1％BSA、20mMのHEPES、pH = 7.4）に、ミックス、血球計算盤（通常> 95％はPMNである）を用いて細胞をカウント10mlを追加します。
   注：細胞をカウントしながら氷上で細胞懸濁液をチューブに保管してください。
10. 以前と同じように遠心分離し、10℃PMNを再懸濁寒さの中7細胞/ ml（4℃）をPBS。氷上で保存する。
    注：好中球が4で約6〜8時間、℃で生存可能で機能的なままである。

2。 PMNのアクティブ化

1. 1.5mlのエッペンドルフチューブにPMNの懸濁液100μl（1×10 ⁷細胞/ ml）を入れてください。
   注：サンプルチューブが少なくとも重複で行われるべきです。いつものネガティブコントロールのみのみ一次抗体、二次抗体を含むべきである。
2. 10μg/ mlで対応する抗インテグリンまたは抗Fc受容体モノクローナル抗体（mAb）を追加し、氷上で15分間インキュベートする。
3. 1 mlの冷（4℃）、PBS、遠心機で1743×gで（4,500 rpm）で遠心分離し、上清を吸引する。を追加することにより、PMNを洗う
4. ラックに対してチューブの底をタップすることで、細胞ペレットを壊し、1ミリリットルの冷PBSを追加し、2回以上前のステップのように洗ってください。
   注：これらは結合していない抗体を除去洗う。
5. 同じで再懸濁し、PMN（内暖かいのitial）体積（37℃）Fの60μg/ mlの（ab '）2ヤギ抗マウスIgGを含むPBS。
   注：二次抗マウスIgG抗体は、最初の抗受容体抗体に結合し、受容体の架橋を引き起こすでしょう。
6. 興味のある核因子に応じて1〜20分、37℃でインキュベートする。 NF-κBは通常15分間、通常はエルク-1で5分間。
   注：37℃で細胞をインキュベート4では行われません°C誘導する受容体架橋、℃
7. 1ミリリットルの冷PBSを加え、遠心機で1743×gで3分間遠心する。
8. 上清を除去
9. dry-ice/ethanol浴ですぐにPMNを凍結し、10分間そこに保管してください。

3。核の単離および固定

1. 100μlの冷（4℃）低張緩衝液（10mMのHEPES、10mMのKCl、1.5mMのMgCl _2、再懸濁し、凍結PMNペレットと 1mMのたて付加_DL-ジチオスレイトール[DTT];でpH = 7.9）。それが1つdry-ice/ethanol浴1からチューブを取り出して、そして低張緩衝液を加える前にチューブの底をきれいに拭くことをお勧めします。
2. 氷の上に置き、トリパンブルーによる核懸濁液のアリコートを染色することによって核の整合性をチェックします。核は円形と青に見える。無傷PMNは、ステンド取得しないと、細胞の破片は、不規則な形状の青色粒子として表示されます。
   注：核懸濁液は、多くの無傷細胞やゴミが含まれている場合、それは準備を破棄し、別のサンプルを使用して手順を繰り返すことをお勧めします。
3. 寒い部屋の中で10分間遠心機で775×gで（3,000 rpm）で核を遠心分離します。非常に壊れやすく、余分であるこの時点で核ケアはサンプルは低温に保ち、過度の力で遠心分離していない場合は注意が必要です。
4. 非常に注意深くピペッティングにより上清を除去します。
5. 核を修正するために、PBS中の冷たい4％パラホルムアルデヒドを100μlを加える。
   注：ペレットは非常に緩んでいるDバッファを追加することで核を再懸濁するのに十分です。上下にピペッティングとは避けるべきである。
6. 氷上で20分間インキュベートします。
7. Immunolabelフローサイトメトリーのための核または4で最大24時間のためにそれらを保つ℃に

4。フローサイトメトリー分析のための核免疫標識

1. 1分間遠心機で1743×gで（4,500 rpm）で核を遠心し、非常に穏やかにピペッティングにより上清を除去します。
2. 風邪を100μl（4℃）0.1％トリトンX-100、PBS中の4％パラホルムアルデヒド核を透過性にするために追加します。 10分間氷上でインキュベートする。
3. 遠心機で1743×gで透過処理した核を遠心分離し、上清を注意深く除去します。この時点で核ペレットがチューブの底にうまく接続しないでください。これは、ペレットが緩ん得れば再度遠心操作することをお勧めします。
4. 非特異的結合部位をブロックし、氷上で20分間インキュベートし、PBS中の冷4％ウシ胎児血清（FBS）500μlに再懸核。遠心遠心機で3分間1743 xgで核と慎重に上清を除去する。
5. 4パーセントFBSおよび興味のある核因子に対するmAbの2.5μg/ mlを含有する冷100μlのPBSに再懸濁し核。氷上で20分間インキュベートします。
   注：通常のネガティブコントロールのみ抗核因子抗体が含まれ、FITC標識二次抗体のみ必要があります。
6. 4パーセントFBSおよび3分間1743 xgで遠心分離して冷PBS500μlで2回洗浄する。
7. 、非常に慎重に4パーセントFBSおよび対応するFITC標識二次抗体10μg/ mlを含有する冷100μlのPBSに再懸濁した核を上清を除去し、氷上で20分間インキュベートします。
8. 前のステップのように4％FBSを冷PBS500μlで二回核を洗ってください。
9. PBS中で冷4％パラホルムアルデヒド400μlの中の核を再懸濁します。
   注：核は、サンプルが汚染することなく、数日間保存できるようにパラホルムアルデヒドに配置されている血清の存在下で発生する可能性のある問題。
10. 4℃の暗所では、フローサイトメトリーやストアによって直ちに分析℃で3日間までのC。

5。フローサイトメトリー分析

1. または同様の装置、フローサイトメーターなどFACスキャン（フランクリンレイクス、ニュージャージー州Becton Dickinson社製）で免疫標識核を分析します。
2. 196でログスケールでSSC、およびドットプロットのゲート核、10-1でログスケールでFSC：に取得設定を調整します。
3. サンプルあたり1万核を獲得。
4. 400℃で対数スケールに設定FL-1チャネル（506 nm）を介して、FITC-染色された核の蛍光分析。

結果

ここに記載の精製方法は、通常は95％（ 図1A）を超える純度を有する非刺激好中球（PMN）を提供しています。隔離されたPMNはその後、特定のモノクローナル抗体で架橋する特定の受容体によって刺激することができる。我々は、Fc受容体とインテグリン（ 図1B）を介してPMNを刺激してきた。一度刺激、PMNを溶解し、核を高収率で分離されています。核は、そのような?...

ディスカッション

ここに記載の精製方法は、短時間で95％（顕微鏡観察により評価）、より高い純度を持つ非刺激好中球の分離（PMN）が可能になります。後者は完全に溶解されていない場合、時には好中球は、赤血球によって汚染することができます。赤血球及びPMNを簡単にフローサイトメトリーによって異なる細胞集団として区別することができるので、これは通常、技術に影響を与えません。隔離されたPM...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur