Un metodo semplice ed efficace per rilevare l'attivazione del Fattore Nucleare in neutrofili umani mediante citometria a flusso

Riepilogo

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue. Neutrofili possiedono funzioni trascrizionalmente regolate, quali la produzione di citochine pro-infiammatorie e l'inibizione di apoptosi. Queste funzioni possono essere studiati con il metodo presentato qui, che consente il rilevamento e la quantificazione dei fattori nucleari mediante citometria a flusso in nuclei isolati

Abstract

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico. Queste cellule sono i primi a comparire nei siti di infiammazione e infezione, diventando così la prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi. Neutrofili possiedono importanti funzioni antimicrobici come fagocitosi, il rilascio di enzimi litici, e la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Oltre a queste funzioni di difesa importanti, neutrofili svolgere altri compiti in risposta alle infezioni come la produzione di citochine proinfiammatorie e inibizione di apoptosi. Le citochine reclutare altri leucociti che aiutano a eliminare l'infezione, e l'inibizione di apoptosi dei neutrofili permette di vivere più a lungo nel sito di infezione. Queste funzioni sono regolate a livello di trascrizione. Tuttavia, poiché i neutrofili sono cellule di breve durata, lo studio delle risposte trascrizionalmente regolati in queste cellule non può essere eseguita con metodi convenzionali geni reporter in quanto non sono effitecniche cienti per la trasfezione dei neutrofili. Qui, presentiamo un metodo semplice ed efficace che permette la rilevazione e la quantificazione dei fattori nucleari in nuclei isolati e immunolabeled mediante citometria a flusso. Si descrivono tecniche per isolare neutrofili pure da sangue periferico umano, stimolare queste cellule con anticorpi anti-recettore, isolare e nuclei immunolabel, e analizzare nuclei mediante citometria a flusso. Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB e Elk-1 fattori nucleari in nuclei di neutrofili e altri tipi di cellule. Pertanto, questo metodo rappresenta un'opzione per analizzare l'attivazione di fattori di trascrizione in nuclei isolati da una varietà di tipi cellulari.

Introduzione

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue periferico ^1. Durante neutrofili infiammazione e l'infezione sono le prime cellule a comparire presso il sito interessato dove agiscono come prima linea di difesa ^2. Neutrofili possiedono diversi meccanismi antimicrobici ³ tra cui la fagocitosi, la produzione di specie reattive dell'ossigeno, rilascio di enzimi litici di degranulazione, e la produzione di citochine proinfiammatorie ^4,5. I neutrofili sono di breve durata cellule che vengono rapidamente attivati ​​tramite segnalazione da vari recettori della superficie cellulare. Sebbene neutrofili sono state considerate cellule terminali a causa della loro breve vita e perché subiscono apoptosi meno attiva durante il processo infiammatorio ^6, è chiaro che possono anche modificare il loro fenotipo cambiando il livello di trascrizione di geni specifici. La produzione di citochine ⁵ e l'inibizione dell'apoptosi ^7,8 sono due importante attivazione-dipendente funzioni cellulari regolati a livello di trascrizione dei neutrofili. Fattore nucleare kB (NF-kB) partecipa al controllo trascrizionale del ⁴ citochine produzione e nella regolazione della sopravvivenza cellulare e apoptosi ^9-11 in vari tipi di cellule.

Le vie di segnalazione che portano alla attivazione del fattore nucleare sono di solito studiati da saggi reporter gene o da saggi elettroforetici spostamento di mobilità (EMSA). Tuttavia, poiché i neutrofili sono cellule di breve durata, lo studio delle risposte trascrizionalmente regolati in queste cellule non possono essere eseguite con saggi reporter gene, poiché non ci sono tecniche efficienti per la transfezione neutrofili. Saggi EMSA sono stati utilizzati in neutrofili per esplorare l'attivazione del fattore nucleare ^12,13, tuttavia, questa metodologia è complicato e costoso in quanto prevede l'utilizzo di materiale radioattivo. Nucleofection è un'altra tecnica che è stata utilizzata successfully per trasfettare monociti ^14. Così, almeno in teoria, attivazione del fattore nucleare potrebbe essere rilevato in neutrofili di trasfezione (nonostante bassa efficienza). Tuttavia, questa tecnica sarebbe più costoso, richiede tempo e probabilmente meno quantitativa. Analisi microscopica delle cellule immunocolorate potrebbe anche essere utilizzato per rilevare fattori nucleari nel nucleo. Abbiamo infatti rilevato NF-kB traslocazione nel nucleo in questo modo ^15. Sfortunatamente, questa tecnica è anche tempo, meno quantitativi, e soggetti a bias dell'osservatore.

Qui, presentiamo un metodo semplice ed efficace che permette la rilevazione e la quantificazione dei fattori nucleari in nuclei isolati e immunolabeled mediante citometria a flusso. Si descrivono tecniche per isolare neutrofili dal sangue periferico umano, stimolare queste cellule via integrine o recettori Fc con anticorpi anti-recettore, isolare e nuclei immunolabel, e analizzare nuclei mediante citometria a flusso (Figura 1). Il metodo è stato utilizzato con successo per rilevare NF-KB ¹⁵ e Elk-1 ¹⁶ fattori nucleari nei nuclei dei neutrofili. La sensibilità di questo metodo consente la rilevazione di piccole variazioni di livelli di fattori nucleari nel nucleo. Questo metodo può anche essere usato per analizzare il livello di fattori di trascrizione in nuclei da altri tipi di cellule.

Protocollo

1. Isolamento dei neutrofili (PMN) dal sangue umano

1. Usare circa 20 ml di sangue umano con eparina (10 U / ml) come anticoagulante. Il sangue è stato raccolto da volontari adulti sani venopuncture. Tutti gli esperimenti sono stati fatti in fase di approvazione del comitato di bioetica presso l'Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
2. Mettere 2 ml di destrano al 6% T500 in PBS in una provetta da 15 ml conica per centrifuga e aggiungere 10 ml di sangue. Mescolare capovolgendo la provetta due o tre volte e lasciare riposare per 45 minuti per consentire la sedimentazione degli eritrociti.
3. In una nuova provetta 15 ml conica per centrifuga mettere 5 ml di Ficoll-Paque.
4. Prendere il plasma ricco di leucociti che formano sopra eritrociti sedimentati, e accuratamente pipettare sopra il Ficoll-Paque formare un secondo strato. Assicurarsi che non ci sono due fasi.
5. Centrifugare a 516 xg per 20 min a 4 ° C. Dopo centrifugazione, all'interfase di plasma e Ficoll-Paque vi è uno strato di cellule mononucleate. Neutrophils sono al fondo della provetta.
6. Eliminare il supernatante, il pellet di cellule rompere toccando il tubo contro un rack, e risospendere le cellule aggiungendo 10 ml di freddo (4 ° C) PBS Nota:. Risospensione delle cellule pipettando su e giù non è consigliabile poiché questo è troppo danni alle cellule.
7. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 ml conica e centrifugare a 290 xg per 5 minuti a 4 ° C.
8. Rompere il pellet cellulare come prima e aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) soluzione ipotonica (0,2% NaCl, 1% BSA, Hepes 20 mM, pH = 7,4) per lisare gli eritrociti. Mescolare agitando delicatamente il tubo a mano per un minuto esatto.
9. Aggiungere 10 ml di freddo (4 ° C) soluzione ipertonica (1,6% NaCl, 1% BSA, HEPES 20 mM, pH = 7,4), mix e contare le cellule utilizzando un emocitometro (generalmente> 95% sono PMN).
   Nota: Tenere il tubo con la sospensione cellulare sul ghiaccio mentre il conteggio delle cellule.
10. Centrifugare come prima e risospendere PMN alle 107 cellule / ml a freddo (4 ° C) PBS. Tenere su ghiaccio.
    Nota: neutrofili rimangono vitali e funzionali a 4 ° C per circa 6-8 ore.

2. Attivazione di PMN

1. Messo 100 pl di sospensione di PMN (1 x 10 ⁷ cellule / ml) in una provetta Eppendorf da 1,5 ml.
   Nota: Vial per campione deve essere fatto almeno in doppio. Usuali controlli negativi dovrebbe includere primo anticorpo solo, e solo anticorpo secondario.
2. Aggiungere il corrispondente anticorpo anti-recettore di integrina o anti-Fc monoclonale (mAb) a 10 pg / ml ed incubare su ghiaccio per 15 min.
3. Lavare PMN aggiungendo 1 ml di freddo (4 ° C) PBS, centrifugazione a 1.743 xg (4.500 rpm) in una microcentrifuga, e l'aspirazione del supernatante.
4. Rompere il pellet di cellule colpendo la parte inferiore del tubo contro un rack, aggiungere 1 ml di PBS freddo, e lavare due volte come nel passaggio precedente.
   Nota: Questi lava rimozione dell'anticorpo non legato.
5. Risospendere in PMN stessa (initial) volume di caldo (37 ° C) PBS contenente 60 ug / ml di F (ab ') 2 di capra anti-IgG di topo.
   Nota: Il secondario anti-topo IgG si legano al primo anticorpo anti-recettore e causerà reticolazione del recettore.
6. Incubare a 37 ° C per 1 a 20 minuti, a seconda del fattore nucleare di interesse. Per NF-kB in genere 15 min, e di solito Elk-1 5 min.
   Nota: incubando le cellule a 37 ° C reticolazione recettore induce, che non può avvenire a 4 ° C.
7. Aggiungere 1 ml di PBS freddo e centrifugare 3 minuti a 1743 xg in microcentrifuga.
8. Rimuovere il surnatante
9. Congelare PMN immediatamente in bagno dry-ice/ethanol e tenerli lì per 10 min.

3. L'isolamento e la fissazione dei Nuclei

1. Risospendere congelati PMN pellet in 100 ul a freddo (4 ° C) tampone ipotonico (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM _MgCl2, e 1 mM appena aggiunto _{DL-ditiotreitolo} [DTT], PH = 7,9). Si consiglia di adottare le provette dal bagno dry-ice/ethanol uno per uno, e per pulire il fondo della provetta prima di aggiungere il tampone ipotonico.
2. Posto su ghiaccio, e verificare l'integrità dei nuclei dalla colorazione un'aliquota della sospensione nuclei con tripan blu. Nuclei guardarsi attorno e blu. PMN intatto non si macchiano, e detriti cellulari appare come particelle blu di forma irregolare.
   Nota: Se la sospensione nuclei contiene molte cellule intatte o detriti, è meglio scartare la preparazione e ripetere la procedura con un altro campione.
3. Centrifugare a 775 xg nuclei (3.000 rpm) in microcentrifuga per 10 minuti all'interno di una cella frigorifera. A questo punto i nuclei sono molto fragili e la cura supplementare dovrebbe essere presa nel mantenere i campioni a freddo e non centrifugazione a una forza eccessiva.
4. Rimuovere il surnatante pipettando molto attenti.
5. Aggiungere 100 ml di freddo paraformaldeide 4% in PBS per fissare nuclei.
   Nota: Il pellet è molto perdere unad aggiungendo il buffer è sufficiente per risospendere il nuclei. Pipettando su e giù dovrebbe essere evitato.
6. Incubare su ghiaccio per 20 min.
7. Nuclei Immunolabel per citometria a flusso o tenerli per un massimo di 24 ore a 4 ° C.

4. Immunomarcatura Nuclei di Analisi Citometria a Flusso

1. Centrifugare a 1743 xg nuclei (4.500 rpm) in microcentrifuga per 1 min, e rimuovere il surnatante pipettando molto delicato.
2. Aggiungere 100 pl di freddo (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldeide in PBS a permeabilize nuclei. Incubare in ghiaccio per 10 minuti.
3. Centrifugare permeabilizzate nuclei a 1743 xg in microcentrifuga e rimuovere con attenzione il surnatante. A questo punto pellets nuclei non collegare bene al fondo della provetta. Si consiglia di centrifugare di nuovo se il pellet viene sciolto.
4. Nuclei risospendere in 500 pl di freddo 4% di siero bovino fetale (FBS) in PBS per bloccare i siti di legame non specifici, e incubare in ghiaccio per 20 min. Centrifuganuclei a 1743 xg per 3 minuti in microcentrifuga e rimuovere con attenzione il surnatante.
5. Risospendere nuclei in 100 pl di PBS contenente 4% FBS e 2,5 ug / ml di anticorpo monoclonale contro il fattore nucleare di interesse. Incubare su ghiaccio per 20 min.
   Nota: usuali controlli negativi dovrebbe includere anticorpi anti-nucleo unico fattore, e FITC-anticorpo marcato secondaria.
6. Lavare due volte con 500 microlitri di PBS freddo con 4% FBS e centrifugazione a 1743 xg per 3 min.
7. Rimuovere il surnatante molto attentamente, nuclei risospendere in 100 pl di PBS contenente 4% FBS e 10 ug / ml del corrispondente FITC-anticorpo secondario marcato, e incubare in ghiaccio per 20 min.
8. Nuclei lavare due volte con 500 microlitri di PBS freddo con 4% FBS come nel passaggio precedente.
9. Risospendere nuclei in 400 pl di freddo paraformaldeide 4% in PBS.
   Nota: I nuclei sono collocati in paraformaldeide per permettere al campione di essere conservato per diversi giorni senza contaminazioneproblemi che possono verificarsi in presenza di siero.
10. Analizzare immediatamente mediante citometria di flusso o conservare al buio a 4 ° C per un massimo di tre giorni.

5. Citometria a Flusso di analisi

1. Analizzare nuclei immunolabeled in un citofluorimetro un FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) dell'apparecchio o simili.
2. Regolare le impostazioni di acquisizione per: FSC a scala logaritmica a 10-1, SSC a log-scala a 196, e nuclei porta in un dot-plot.
3. Acquisire 10.000 nuclei per campione.
4. Analizzare fluorescenza del FITC-tinto nuclei attraverso la FL-1 canale (506 nm) fissato a scala logaritmica a 400.

Risultati

Il metodo di purificazione qui descritta fornisce solito non stimolate neutrofili (PMN) con purezza superiore al 95% (Figura 1A). PMN isolato può essere stimolato da recettori reticolazione particolari con specifici anticorpi monoclonali. Abbiamo stimolato PMN attraverso recettori Fc e integrine (Figura 1B). Una volta stimolato, PMN vengono lisati e nuclei sono isolati con alte rese. Nuclei sono poi immunolabeled per un particolare fattore nucleare, come il fattore nucleare kB (NF-kB),...

Discussione

Il metodo di purificazione descritto permette l'isolamento dei neutrofili non stimolati (PMN) con purezza superiore al 95% (valutata mediante osservazione al microscopio), in breve tempo. Talvolta neutrofili possono essere contaminati da eritrociti se questi non sono completamente lisati. Questo di solito non pregiudica la tecnica, gli eritrociti e PMN può essere facilmente distinto come distinte popolazioni cellulari mediante citometria a flusso. PMN isolato può essere stimolato da recettori reticolazione partico...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur