פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Summary

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעינים בודדים

Abstract

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי. תאים אלה הם ראשונים שמופיעים באתרים של דלקת וזיהום, ובכך להפוך את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים. נויטרופילים בעלי פונקציות מיקרוביאלית חשובות כגון phagocytosis, שחרורו של אנזימי ממוסס, וייצור של מיני חמצן תגובתי. בנוסף לפונקציות בטחוניות החשובות אלה, נויטרופילים לבצע משימות אחרות בתגובה לזיהום, כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. ציטוקינים לגייס לויקוציטים האחר המסייעים לנקות את הזיהום, ועיכוב של אפופטוזיס מאפשר נויטרופילים לחיות זמן רב יותר באתר של זיהום. פונקציות אלה מוסדרות ברמה של שעתוק. עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות תעתיק מוסדר בתאים אלו לא ניתנים לביצוע בשיטות קונבנציונליות גן כתב מאז אין אפיםטכניקות cient עבור transfection נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד נויטרופילים טהורים מדם היקפי אנושי, לעורר תאים אלו עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה. השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור NF-κB וElk 1-גורמים גרעיניים בגרעינים מנויטרופילים וסוגי תאים אחרים. לכן, שיטה זו מייצגת אפשרות לניתוח הפעלה של גורמי שעתוק בגרעינים בודדים מתוך מגוון של סוגי תאים.

Introduction

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי ^1. במהלך נויטרופילים דלקת והזיהום הם התאים הראשונים שמופיעים באתר המושפע שם הם משמשים כקו ההגנה הראשון ^2. נויטרופילים יש מספר מנגנונים מיקרוביאלית ³ כולל phagocytosis, ייצור של מיני חמצן תגובתי, שחרורו של אנזימי ממוסס ידי degranulation, וייצור של ציטוקינים מעודדים דלקת ^4.5. הנויטרופילים הם תאים קצרי חיים שמקבלים מופעלים במהירות דרך איתות מהקולטנים בתא שטח שונים. למרות נויטרופילים כבר נחשבים תאים סופניים עקב חייו הקצרים שלהם ובגלל שהם עוברים אפופטוזיס אלא אם הופעל במהלך התהליך הדלקתי ^6, עכשיו זה ברור שהם יכולים גם לשנות פנוטיפ שלהם על ידי שינוי ברמה של שעתוק של גנים מסוימים. הייצור של ציטוקינים ⁵ והעיכוב של אפופטוזיס ^7,8 הם שתיים אניפונקציות תא הפעלה תלויה mportant מוסדרות ברמה של שעתוק בנויטרופילים. הגורם הגרעיני κB (NF-κB) משתתף בשליטת התעתיק של ⁴ ייצור ציטוקינים וברגולציה של הישרדות תא ואפופטוזיס ^9-11 בסוגי תאים שונים.

את מסלולי האיתות שיובילו להפעלת פקטור גרעינית בדרך כלל נחקרו על ידי מבחני גן כתב או על ידי מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA). עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות מוסדרות תעתיק בתאים אלה לא ניתן לבצע עם מבחני גן כתב, שכן יש לא טכניקות יעילות לtransfection נויטרופילים. מבחני EMSA כבר בשימוש בנויטרופילים לחקור הפעלת פקטור גרעינית ^12,13, עם זאת, במתודולוגיה זו היא מסובכת ויקרה משום שהיא כרוכה בשימוש בחומר רדיואקטיבי. Nucleofection היא טכניקה נוספת ששמשה successfully לtransfect מונוציטים ^14. לפיכך, לפחות בתאוריה, הפעלת פקטור גרעינית יכולה להיות מזוהית בנויטרופילים ידי transfection (למרות יעילות נמוכה). עם זאת, טכניקה זו תהיה יקרה יותר, זמן רב וכנראה פחות כמותית. ניתוח מיקרוסקופי של תאי immunostained גם יכול לשמש כדי לזהות גורמים גרעיניים בגרעין. ואכן, יש לנו זוהיתי טרנסלוקציה NF-κB לתוך הגרעין זו דרך ^15. למרבה הצער, טכניקה זו היא גם גוזלת זמן, פחות כמותית, ובכפוף להטיה של הצופה.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד הנויטרופילים מדם היקפי אנושי, לעורר התאים האלה באמצעות integrins או קולטנים FC עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה (F1 igure). השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור ¹⁵ NF-κB וElk-1 ¹⁶ גורמים גרעיניים בגרעיני נויטרופילים. הרגישות של שיטה זו מאפשרת זיהוי של שינויים קטנים ברמות פקטור גרעיניים בגרעין. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את הרמה של גורמי שעתוק בגרעינים מסוגי תאים אחרים.

Protocol

1. בידוד של נויטרופילים (PMN) מדם אדם

1. השתמש כ 20 מיליליטר דם אדם בפרין (10 U / ml) כנוגד קרישה. דם נאסף ממתנדבים בריאים במבוגרי venopuncture. כל הניסויים נעשו במסגרת אישור ועדת ביואתיקה במכון Biomédicas Investigaciones דה - UNAM.
2. שים 2 מ"ל של 6% dextran T500 ב PBS לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף 10 מ"ל של דם. מערבב על ידי היפוך הצינורית פעמים או שלוש ולתת לו לשבת במשך 45 דקות על מנת לאפשר לשקיעת דם.
3. בצינור טרי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה לשים 5 מ"ל Ficoll-Paque.
4. קח פלזמה יקוציט העשירה שנוצרה מעל אריתרוציטים משקעים, ופיפטה אותה בזהירות על גבי Ficoll-Paque יצירת שכבה שנייה. ודא שיש שני שלבים.
5. צנטריפוגה ב XG 516 עבור 20 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, בשלבי ביניים של פלזמה וFicoll-Paque יש שכבה של תאי mononuclear. Neutrophils נמצא בתחתית של התחתית.
6. בטל supernatant, לשבור את תא גלולה על ידי קשה על הצינור כנגד מדפים, וresuspend התאים על ידי הוספת 10 מ"ל של קר (4 ° C) PBS הערה:. Resuspending תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה אינו מומלצת, מאחר שזו גם ניזק לתאים.
7. להעביר את השעית התא לצינור 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה וצנטריפוגה XG ב 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
8. לשבור את התא הגלול כמו קודם ולהוסיף 10 מ"ל של קר (4 ° C) פתרון hypotonic (0.2% NaCl, 1% BSA, 20 Hepes מ"מ, pH = 7.4) לlyse אריתרוציטים. מערבב בעדינות מתערבל צינור ביד דקה אחת בדיוק.
9. הוסף 10 מ"ל של קר (4 ° C) פתרון hypertonic (1.6% NaCl, 1% BSA, 20 HEPES מ"מ, pH = 7.4), לערבב וספירת התאים באמצעות hemocytometer (בדרך כלל> 95% הם PMN).
   שים לב: שמור על הצינור עם השעית התא על קרח בעת לספור את התאים.
10. צנטריפוגה כמו קודם וresuspend PMN בשעת 107 תאים / מ"ל בקר (4 ° C) PBS. שמור על קרח.
    הערה: נויטרופילים להישאר קיימא ותפקודי ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 6-8 שעות.

2. הפעלת PMN

1. לשים 100 μl של השעית PMN (1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל) לתוך צינור 1.5 מ"ל אפנדורף.
   הערה: דוגמיות צריכים להיעשות לפחות בכפילויות. פקדים שליליים רגילים צריכים לכלול נוגדן ראשון בלבד, ונוגדן משני בלבד.
2. הוסף הנוגדן אנטי המקביל integrin או נגד Fc רצפטור חד השבטי (MAB) בשעת 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולדגור על קרח במשך 15 דקות.
3. שטוף PMN ידי הוספת 1 מ"ל של קר (4 ° C) PBS, צנטריפוגה XG ב 1743 (4500 סל"ד) בmicrocentrifuge, וaspirating supernatant.
4. לשבור את תא הגלולה על ידי קשה על התחתית של התחתית כנגד מדפים, להוסיף 1 המ"ל PBS הקר, ולשטוף עוד שתי פעמים כמו בשלב קודם.
   הערה: אלה שוטפים להסיר נוגדן מאוגד.
5. PMN resuspend באותה (ב) הנפח של itial חם (37 מעלות צלזיוס) PBS המכיל 60 מיקרוגרם / מ"ל ​​של F (ab ') 2 עיזים אנטי עכבר IgG.
   הערה: נוגדן IgG המשני אנטי העכבר יהיה לאגד את הנוגדן אנטי-1 רצפטור ויגרום crosslinking של הקולטן.
6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס 1 עד 20 דקות, תלויות בגורם הגרעיני של עניין. לNF-κB בדרך כלל 15 דקות, ולאלק-1 בדרך כלל 5 דקות.
   הערה: דגירת התאים ב 37 ° C crosslinking גורם קולט, שלא יכול לקחת את המקום ב 4 ° C.
7. הוסף 1 המ"ל PBS הקר וסרכזת 3 דקות ב1743 XG בmicrocentrifuge.
8. הסרת supernatant
9. הקפא PMN מייד באמבטית dry-ice/ethanol ולהשאיר אותם שם למשך 10 דקות.

3. בידוד וקיבוע של גרעינים

1. Resuspend הקפוא PMN גלול ב קר μl 100 (4 מעלות צלזיוס) חיץ hypotonic (10 HEPES מ"מ, 10 המ"מימ KCl, 1.5 המ"מ MgCl _2, ו 1 mM הטרי מוסף _{DL-dithiothreitol} [DTT], PH = 7.9). מומלץ לקחת את הצינורות שיצאו מאמבטית dry-ice/ethanol אחד אחד, ולנגב לנקות את התחתית של תחתית לפני ההוספה למאגר hypotonic.
2. מניח על קרח, ולבדוק את שלמות גרעינים ע"י השאיר aliquot ההשעיה של גרעינים עם trypan כחול. גרעינים נראים עגולים וכחולים. PMN השלם לא מקבל מוכתם, ופסולת תא מופיעה כחלקיקים כחולים של צורה לא סדירה.
   הערה: אם השעית גרעינים מכילה תאים שלמים או פסולת רבים, עדיף למחוק ההכנה ולחזור על התהליך עם דוגמה אחרת.
3. צנטריפוגה גרעינים ב775 XG (3,000 סל"ד) בmicrocentrifuge למשך 10 דקות בתוך חדר קר. בגרעיני נקודה זו טיפול מאוד שביר ונוסף יש לנקוט בשמירה על הדגימות קרות ולא צנטריפוגה בכוחות מוגזמים.
4. הסרת supernatant ידי pipetting זהיר מאוד.
5. הוסף 100 μl של paraformaldehyde 4% הקרים ב PBS לתקן גרעינים.
   הערה: הגלולה מאוד רופפתד הוסיף למאגר הוא מספיק כדי resuspend הגרעינים. Pipetting למעלה ולמטה יש להימנע.
6. לדגור על קרח למשך 20 דקות.
7. גרעיני Immunolabel עבור cytometry זרימה או לשמור אותם לתקופה של עד 24 שעות ב 4 ° C.

4. Immunolabeling גרעינים לניתוח cytometry זרימה

1. צנטריפוגה גרעינים ב1743 XG (4500 סל"ד) בmicrocentrifuge ל1 דקות, ולהסיר supernatant ידי pipetting עדין מאוד.
2. הוסף 100 μl של קר (4 ° C) 0.1% Triton X-100, paraformaldehyde 4% ב PBS לpermeabilize גרעינים. דגירה בקרח למשך 10 דקות.
3. צנטריפוגה permeabilized גרעינים ב1743 XG בmicrocentrifuge ולהסיר את supernatant בזהירות. בשלב זה כדורי גרעינים לא מייחסים גם בתחתית של התחתית. מומלץ סרכזת שוב אם הגלולה מתרופפת.
4. גרעיני resuspend ב 500 μl של סרום קר 4% עוברי שור (FBS) ב PBS לחסום אתרי קישור לא ספציפיים, ולדגור על קרח למשך 20 דקות. סרכזתגרעינים ב1743 XG ל3 דקות בmicrocentrifuge ולהסיר את supernatant בזהירות.
5. Resuspend גרעינים ב100 μl של PBS הקר המכיל 4% FBS ו 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של MAB נגד הגורם הגרעיני של עניין. לדגור על קרח למשך 20 דקות.
   הערה: פקדים שליליים רגילים צריכה לכלול נוגדן גורם אנטי גרעיני בלבד, וFITC שכותרתו נוגדן משני בלבד.
6. שטוף פעמים עם 500 μl של PBS הקר עם 4% FBS וצנטריפוגה XG ב 1743 עבור 3 דקות.
7. הסר את supernatant מאוד בזהירות, גרעיני resuspend ב 100 μl של הקור PBS המכיל 4% FBS ו 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של הנוגדן המשני המקביל FITC כותרתו, ולדגור על קרח למשך 20 דקות.
8. שטוף פעמים עם גרעינים 500 μl של הקור PBS עם 4% FBS כמו בשלב קודם.
9. Resuspend גרעינים ב400 μl של paraformaldehyde 4% הקרים ב PBS.
   הערה: גרעינים ממוקמים בparaformaldehyde כדי לאפשר את המדגם כדי להיות מאוחסן במשך מספר ימים ללא זיהוםבעיות שיכולות להתרחש בנוכחות הסרום.
10. לנתח באופן מיידי על ידי cytometry זרימה או בחנות בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים.

5. ניתוח זרימת cytometry

1. נתח גרעיני immunolabeled בcytometer זרימה כגון FACScan (הקיטון דיקינסון; פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי) או מכשיר דומה.
2. התאם את גדרות רכישה ל: FSC ביומן בקנה מידה 10-1, SSC ביומן בקנה מידה 196, וגרעינים בשער הדוט עלילה.
3. תרכוש 10,000 גרעינים למדגם.
4. נתח את הקרינה של גרעינים FITC מוכתמים דרך ערוץ FL-1 (506 ננומטר) המוגדר ביומן בקנה מידה ב 400.

תוצאות

שיטת הטיהור המתוארת כאן בדרך כלל מספק נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (איור 1 א). PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. יש לנו מגורה PMN דרך קולטנים וintegrins FC (1B איור). ברגע מגורה, PMN הם lysed וגרעינים...

Discussion

שיטת הטיהור המתוארת כאן מאפשרת בידוד של נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (הערכה על ידי תצפית מיקרוסקופית), בזמן קצר. לפעמים הנויטרופילים יכולים להיות מזוהמים על ידי אריתרוציטים אם האחרון לא lysed לחלוטין. זה בדרך כלל אינו משפיע על הטכניקה, שכן בקלות ניתן להבחין אר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur