Une méthode simple et efficace pour détecter l'activation du facteur nucléaire dans les neutrophiles humains par cytométrie en flux

Résumé

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang. Les neutrophiles possèdent des fonctions transcription régulés tels que la production de cytokines pro-inflammatoires et l'inhibition de l'apoptose. Ces fonctions peuvent être étudiés avec la méthode présentée ici, qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires par cytométrie en flux dans les noyaux isolés

Résumé

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique. Ces cellules sont les premiers à apparaître sur les sites de l'inflammation et de l'infection, devenant ainsi la première ligne de défense contre les micro-organismes envahisseurs. Les neutrophiles possèdent d'importantes fonctions antimicrobiennes tels que la phagocytose, la libération d'enzymes lytiques, et la production d'espèces réactives de l'oxygène. En plus de ces fonctions de défense importants, les neutrophiles effectuer d'autres tâches en réponse à l'infection, comme la production de cytokines pro-inflammatoires et l'inhibition de l'apoptose. Cytokines recruter d'autres leucocytes qui aident à éliminer l'infection, et l'inhibition de l'apoptose des neutrophiles permet de vivre plus longtemps sur le site de l'infection. Ces fonctions sont réglementés au niveau de la transcription. Cependant, parce que les neutrophiles sont des cellules de courte durée, l'étude des réponses transcriptionnellement réglementées dans ces cellules ne peuvent pas être effectuées avec les méthodes classiques de gènes rapporteurs puisqu'il n'y a pas effitechniques santes pour la transfection des neutrophiles. Ici, nous présentons une méthode simple et efficace qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires dans des noyaux isolés et immunomarquées par cytométrie en flux. Nous décrivons les techniques pour isoler les neutrophiles purs à partir de sang périphérique humain, de stimuler ces cellules avec des anticorps anti-récepteurs, d'isoler et de noyaux immunolabel, et d'analyser les noyaux par cytométrie en flux. La méthode a été utilisée avec succès pour détecter NF-kB et Elk-1 facteurs nucléaires dans les noyaux des neutrophiles et d'autres types cellulaires. Ainsi, cette méthode représente une option pour analyser l'activation des facteurs de transcription dans des noyaux isolés à partir d'une variété de types de cellules.

Introduction

Les neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang périphérique ^1. Au cours de neutrophiles inflammation et l'infection sont les premières cellules à apparaître sur le site touchée où ils agissent comme première ligne de défense ^2. Les neutrophiles possèdent plusieurs mécanismes antimicrobiens ^3, notamment la phagocytose, production d'espèces réactives de l'oxygène, la libération d'enzymes lytiques par la dégranulation et la production de cytokines pro-inflammatoires ^4,5. Les neutrophiles sont des cellules de courte durée qui se rapidement activés par la signalisation de divers récepteurs de surface cellulaire. Bien que les neutrophiles ont été considérés cellules terminales en raison de leur courte durée de vie et parce qu'ils subissent une apoptose à moins activées pendant le processus inflammatoire ^6, il est maintenant clair qu'ils peuvent également modifier leur phénotype en changeant le niveau de la transcription de gènes particuliers. La production de cytokines ⁵ et l'inhibition de l'apoptose ^7,8 sont deux important fonctions cellulaires dépendant de l'activation régulée au niveau de la transcription dans les cellules neutrophiles. Le facteur nucléaire kB (NF-kB) participe à la régulation transcriptionnelle de ⁴ la production de cytokines et dans la régulation de la survie cellulaire et l'apoptose ^9-11 dans différents types cellulaires.

Les voies de signalisation qui conduisent à l'activation du facteur nucléaire sont habituellement étudiées par des essais de gène rapporteur ou par électrophorèse des essais de décalage de mobilité (EMSA). Cependant, parce que les neutrophiles sont des cellules de courte durée, l'étude des réponses transcription régulés dans ces cellules ne peuvent pas être réalisées avec des dosages de gènes rapporteurs, car il n'existe pas de techniques efficaces pour la transfection des neutrophiles. Analyses EMSA ont été utilisés dans les neutrophiles d'explorer l'activation du facteur nucléaire ^12,13; toutefois, cette méthode est compliquée et coûteuse car elle implique l'utilisation de matières radioactives. Nucléofection est une autre technique qui a été utilisée successfully pour transfecter monocytes ^14. Ainsi, au moins en théorie, l'activation du facteur nucléaire a pu être détectée dans les neutrophiles par transfection (malgré la faible efficacité). Cependant, cette technique serait plus coûteux, fastidieux et probablement moins quantitative. L'analyse microscopique des cellules immunocolorées pourrait également être utilisé pour détecter les facteurs nucléaires dans le noyau. En effet, nous avons détecté une translocation de NF-kB dans le noyau de cette façon ^15. Malheureusement, cette technique est aussi beaucoup de temps, moins quantitative, et sujettes à des biais de l'observateur.

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace qui permet la détection et la quantification des facteurs nucléaires dans des noyaux isolés et immunomarquées par cytométrie en flux. On décrit des techniques pour isoler des neutrophiles du sang périphérique humain, stimuler ces cellules par l'intermédiaire des intégrines ou des récepteurs Fc avec des anticorps anti-récepteurs, d'isoler et de noyaux immunolabel, et analyser les noyaux par cytométrie de flux (Figure 1). La méthode a été utilisée avec succès pour détecter NF-kB ¹⁵ et Elk-1 ¹⁶ facteurs nucléaires dans les noyaux des neutrophiles. La sensibilité de cette méthode permet la détection de petits changements dans les niveaux de facteurs nucléaires dans le noyau. Cette méthode peut également être utilisée pour analyser le niveau des facteurs de transcription dans le noyau à partir d'autres types cellulaires.

Protocole

1. Isolement des neutrophiles (PMN) à partir de sang humain

1. Utilisez environ 20 ml de sang humain avec de l'héparine (10 U / ml) comme anticoagulant. Le sang a été recueilli à partir adultes volontaires en bonne santé par ponction veineuse. Toutes les expériences ont été réalisées en cours d'approbation du Comité de bioéthique à l'Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
2. Mettre 2 ml de 6% de dextrane T500 dans du PBS dans un tube à centrifuger conique de 15 ml et ajouter 10 ml de sang. Mélanger en inversant le tube deux ou trois fois et laisser reposer pendant 45 min pour permettre de sédimentation.
3. Dans un tube à centrifuger frais 15 ml conique mettre 5 ml de Ficoll-Paque.
4. Prenez le plasma riche en leucocytes qui s'est formé au-dessus érythrocytes sédimentés, et soigneusement pipette au-dessus du Ficoll-Paque former une deuxième couche. Assurez-vous qu'il ya deux phases.
5. Centrifuger à 516 xg pendant 20 min à 4 ° C. Après centrifugation, à l'interphase de plasma et de Ficoll-Paque se trouve une couche de cellules mononucléées. Neutrophils sont au fond du tube.
6. Eliminer le surnageant, briser le culot cellulaire en appuyant sur ​​le tube contre une grille, et remettre les cellules en ajoutant 10 ml d'eau froide (4 ° C) PBS. Remarque: La remise en suspension des cellules par pipetage de haut en bas n'est pas recommandée car elle est trop dommageables pour les cellules.
7. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifugation de 50 ml coniques et centrifuger à 290 xg pendant 5 min à 4 ° C.
8. Briser le culot cellulaire comme avant et ajouter 10 ml d'eau froide (4 ° C) une solution hypotonique (0,2% de NaCl, 1% de BSA, 20 mM de HEPES, pH = 7,4) pour lyser les érythrocytes. Mélanger en agitant doucement le tube à la main pendant exactement une minute.
9. Ajouter 10 ml d'eau froide (4 ° C) solution hypertonique (1,6% de NaCl, 1% de BSA, 20 mM d'HEPES, pH = 7,4), mélanger et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre (généralement> 95% sont des PMN).
   Remarque: Conservez le tube avec la suspension cellulaire sur la glace tout en comptant les cellules.
10. Centrifuger comme avant et remettre en suspension PMN à 107 cellules / ml dans le froid (4 ° C) PBS. Garder sur la glace.
    Remarque: Les neutrophiles demeurer viable et fonctionnelle à 4 ° C pendant environ 6 à 8 heures.

2. Activation PMN

1. Mettez 100 pl de suspension de PMN (1 x 10 ⁷ cellules / ml) dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
   Remarque: Les tubes échantillons doivent se faire au moins en double. Habituelles du contrôle négatif doit inclure premier anticorps seul, et l'anticorps secondaire.
2. Ajouter l'anticorps récepteur correspondant anti-intégrine ou anti-Fc monoclonal (Acm) à 10 pg / ml et incuber sur de la glace pendant 15 min.
3. Laver PMN en ajoutant 1 ml d'eau froide (4 ° C) PBS, centrifugation à 1743 xg (4.500 rpm) dans une microcentrifugeuse, et l'aspiration du surnageant.
4. Briser le culot cellulaire en appuyant sur la partie inférieure du tube contre une grille, ajouter 1 ml de PBS froid, et laver deux fois plus que lors de l'étape précédente.
   Remarque: Ce lave éliminer les anticorps non liés.
5. PMN remettre en suspension dans la même (enitial) le volume d'eau tiède (37 ° C) PBS contenant 60 ug / ml de F (ab ') 2 de chèvre anti-IgG de souris.
   Remarque: Le secondaire anti-IgG de souris se lie à la première anticorps anti-récepteur et provoquer la réticulation du récepteur.
6. Incuber à 37 ° C pendant 1 à 20 min, en fonction du facteur nucléaire de l'intérêt. Pour le NF-kB généralement de 15 min, et pour Elk-1 habituellement de 5 min.
   Remarque: L'incubation des cellules à 37 ° C réticulation récepteur induit, ce qui ne peut avoir lieu à 4 ° C.
7. Ajouter 1 ml de PBS froid et centrifuger 3 min à 1743 xg dans microcentrifugeuse.
8. Retirer le surnageant
9. Congelez PMN immédiatement dans le bain dry-ice/ethanol et les y maintenir pendant 10 min.

3. L'isolement et la fixation des noyaux

1. Remettre en suspension congelée PMN concentré dans 100 ul froid (4 ° C) tampon hypotonique (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl _2, et 1 mM fraîchement ajoutée _{DL-dithiothreitol} [DTT], PH = 7,9). Il est recommandé de prendre les tubes du bain une dry-ice/ethanol par un, et pour essuyer le fond du tube avant d'ajouter le tampon hypotonique.
2. Placer sur la glace, et de vérifier l'intégrité des noyaux par coloration d'une aliquote de la suspension noyaux avec du bleu trypan. Noyaux regarder autour et bleu. PMN Intact ne se tacher, et les débris cellulaires apparaît sous forme de particules bleues de forme irrégulière.
   Remarque: Si la suspension contient de nombreux noyaux des cellules intactes ou des débris, il est préférable de jeter la préparation et répéter la procédure avec un autre échantillon.
3. Centrifuger à 775 xg noyaux (3.000 rpm) microcentrifugeuse pendant 10 min dans une chambre froide. A ce point de noyaux sont très fragiles et des soins supplémentaires doivent être prises pour maintenir les échantillons à froid et non centrifugation à des forces excessives.
4. Retirer le surnageant par pipetage très prudent.
5. Ajouter 100 ul de paraformaldéhyde 4% dans du PBS froid pour fixer les noyaux.
   Remarque: Le culot est très facilement perdre uned ajoutant le tampon est suffisant pour remettre en suspension les noyaux. Aspiration et refoulement doit être évitée.
6. Incuber dans la glace pendant 20 min.
7. Noyaux Immunolabel la cytométrie de flux ou de les conserver jusqu'à 24 heures à 4 ° C.

4. L'immunomarquage des noyaux d'analyse de cytométrie en flux

1. Centrifuger à 1743 xg noyaux (4.500 rpm) microcentrifugeuse pendant 1 min, puis retirez surnageant par pipetage très doux.
2. Ajouter 100 ul de froid (4 ° C) 0,1% de Triton X-100, le paraformaldéhyde 4% dans du PBS à perméabiliser noyaux. Incuber dans la glace pendant 10 min.
3. Centrifugeuse perméabilisées noyaux à 1743 xg dans microcentrifugeuse et retirer délicatement le surnageant. A ce stade, pellets noyaux n'attachent pas bien au fond du tube. Il est recommandé de centrifuger à nouveau si le culot se détache.
4. Noyaux remettre en suspension dans 500 ul de sérum froid 4% de veau fœtal (FBS) dans du PBS pour bloquer les sites de liaison non spécifiques, et incuber sur de la glace pendant 20 min. Centrifugernoyaux à 1743 xg pendant 3 min dans microcentrifugeuse et retirer délicatement le surnageant.
5. Resuspendre noyaux dans 100 ul de PBS froid contenant 4% de FBS et 2,5 ug / ml de l'anticorps monoclonal contre le facteur nucléaire des intérêts. Incuber dans la glace pendant 20 min.
   Remarque: Usual contrôles négatifs doivent inclure anticorps anti-facteur nucléaire seulement, et marqué au FITC anticorps secondaire seul.
6. Laver deux fois avec 500 ul de PBS froid avec 4% de FBS et centrifugation à 1743 xg pendant 3 min.
7. Retirer le surnageant avec beaucoup de soin, les noyaux remettre en suspension dans 100 ul de PBS froid contenant 4% de FBS et 10 pg / ml de la correspondante marqué au FITC anticorps secondaire et incuber sur de la glace pendant 20 min.
8. Laver deux fois les noyaux avec 500 ul de PBS froid avec du FBS 4% comme dans l'étape précédente.
9. Remettre en suspension dans 400 ul noyaux de paraformaldéhyde 4% dans du PBS froid.
   Remarque: Les noyaux sont placés dans du paraformaldéhyde à permettre à l'échantillon doit être stocké pendant plusieurs jours sans contaminationproblèmes qui peuvent se produire en présence de sérum.
10. Analyser immédiatement par cytométrie en flux ou conserver à l'obscurité à 4 ° C pendant un maximum de trois jours.

5. Analyse par cytométrie en flux

1. Analyser noyaux immunomarquées dans un cytomètre de flux tels un FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) appareil ou similaire.
2. Réglez les paramètres d'acquisition d': FSC à échelle logarithmique à 10-1, SSC à échelle logarithmique à 196, et les noyaux de grille dans un point-parcelle.
3. Acquérir dix mille noyaux par échantillon.
4. Analyser la fluorescence du FITC-noyaux colorés par l'intermédiaire du canal FL-1 (506 nm) fixé à échelle logarithmique à 400.

Résultats

Le procédé de purification décrit ici fournit habituellement neutrophiles non stimulés (PMN) de pureté supérieure à 95% (figure 1A). PMN isolé peut ensuite être stimulée par les récepteurs spécifiques de réticulation avec des anticorps monoclonaux spécifiques. Nous avons stimulé PMN par le biais des récepteurs Fc et les intégrines (figure 1B). Une fois stimulés, PMN sont lysées et les noyaux sont isolés avec des rendements élevés. Les noyaux sont ensuite immunomarq...

Discussion

Le procédé de purification décrit ici permet d'isoler les neutrophiles non stimulés (PMN) de pureté supérieure à 95% (évaluée par l'observation microscopique), dans un court laps de temps. Parfois, les neutrophiles peuvent être contaminés par les érythrocytes si celui-ci ne sont pas lysées complètement. Cela ne devrait pas nuire à la technique, les érythrocytes et les PMN peuvent facilement être distingués comme des populations cellulaires distinctes par cytométrie en flux. PMN isolé peut ens...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur