Un método simple y eficiente para detectar la activación del factor nuclear en neutrófilos humanos por citometría de flujo

Resumen

Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre. Los neutrófilos poseen funciones regulados transcripcionalmente tales como la producción de citocinas proinflamatorias y la inhibición de la apoptosis. Estas funciones pueden ser estudiadas con el método presentado aquí, que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares por citometría de flujo en los núcleos aislados

Resumen

Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre periférica. Estas células son el primero en aparecer en sitios de inflamación e infección, convirtiéndose así en la primera línea de defensa contra los microorganismos invasores. Los neutrófilos poseen importantes funciones antimicrobianos, tales como fagocitosis, la liberación de enzimas líticas, y la producción de especies reactivas del oxígeno. Además de estas importantes funciones de defensa, neutrófilos realizar otras tareas en respuesta a la infección, tales como la producción de citocinas proinflamatorias y la inhibición de la apoptosis. Las citoquinas reclutar leucocitos otros que ayudan a eliminar la infección, y la inhibición de la apoptosis permite el neutrófilo a vivir más tiempo en el sitio de la infección. Estas funciones se regulan a nivel de la transcripción. Sin embargo, debido a los neutrófilos son las células de vida corta, el estudio de respuestas regulados transcripcionalmente en estas células no se puede realizar con los métodos convencionales de genes informadores ya que no hay eficienciatécnicas eficientes para la transfección de neutrófilos. Aquí, se presenta un método simple y eficiente que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares en núcleos aislados y immunolabeled por citometría de flujo. Se describen técnicas para aislar los neutrófilos puros a partir de sangre periférica humana, estimular estas células con anticuerpos anti-receptor, aislar y núcleos inmunomarcador, y analizar núcleos por citometría de flujo. El método ha sido utilizado con éxito para detectar NF-kB y Elk-1 factores nucleares en los núcleos de los neutrófilos y otros tipos celulares. Por lo tanto, este método representa una opción para el análisis de la activación de factores de transcripción en los núcleos aislados a partir de una variedad de tipos de células.

Introducción

Los neutrófilos son las más abundantes en leucocitos de sangre periférica ^1. Durante los neutrófilos inflamación y la infección son las primeras células que aparecen en el sitio afectado cuando actúan como la primera línea de defensa ^2. Los neutrófilos poseen varios mecanismos antimicrobianos ³ incluyendo la fagocitosis, la producción de especies reactivas de oxígeno, liberación de enzimas líticas por la desgranulación y la producción de citocinas proinflamatorias ^4,5. Los neutrófilos son las células de vida corta que se activa rápidamente a través de la señalización de los distintos receptores de la superficie celular. Aunque los neutrófilos se han considerado las células terminales debido a su corta vida y porque se someten a apoptosis menos que sea activado durante el proceso inflamatorio ^6, ahora está claro que también pueden modificar su fenotipo cambiando el nivel de la transcripción de determinados genes. La producción de citocinas ⁵ y la inhibición de la apoptosis ^7,8 son dos importantes de activación dependientes de funciones de la célula regulada en el nivel de transcripción en los neutrófilos. El factor nuclear kB (NF-kB) participa en el control transcripcional de la producción de citoquinas y ⁴ en la regulación de la supervivencia celular y la apoptosis ^9-11 en varios tipos de células.

Las vías de señalización que conducen a la activación del factor nuclear generalmente se estudian por ensayos de gen reportero o por ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA). Sin embargo, debido a los neutrófilos son las células de vida corta, el estudio de respuestas regulados transcripcionalmente en estas células no se puede realizar con ensayos de gen reportero, ya que no hay técnicas eficaces para la transfección de neutrófilos. Ensayos de EMSA se han utilizado en los neutrófilos para explorar la activación del factor nuclear ^12,13; sin embargo, esta metodología es complicada y cara, ya que implica el uso de materiales radiactivos. Nucleofection es otra técnica que se ha utilizado successfully para transfectar monocitos ^14. Por lo tanto, al menos en teoría, la activación del factor nuclear puede ser detectado en los neutrófilos por transfección (a pesar de la baja eficiencia). Sin embargo, esta técnica sería más costoso, consume tiempo y, probablemente, menos cuantitativo. El análisis microscópico de células inmuno también podría ser utilizado para detectar los factores nucleares en el núcleo. En efecto, hemos detectado NF-kappa B translocación en el núcleo de esta manera ^15. Desafortunadamente, esta técnica es también consume mucho tiempo, menos cuantitativo, y sujeto al sesgo del observador.

Aquí, se presenta un método simple y eficiente que permite la detección y cuantificación de los factores nucleares en núcleos aislados y immunolabeled por citometría de flujo. Se describen técnicas para aislar los neutrófilos de sangre periférica humana, estimular estas células a través de integrinas o receptores de Fc con anticuerpos anti-receptor, aislar y núcleos inmunomarcador, y analizar núcleos por citometría de flujo (Figura 1). El método ha sido utilizado con éxito para detectar NF-kB ¹⁵ y Elk-1 ¹⁶ factores nucleares en los núcleos de neutrófilos. La sensibilidad de este método permite la detección de pequeños cambios en los niveles de factor nuclear en el núcleo. Este método también se puede utilizar para analizar el nivel de factores de transcripción en los núcleos de otros tipos de células.

Protocolo

1. Aislamiento de neutrófilos (PMN) de la sangre humana

1. Use aproximadamente 20 ml de sangre humana con heparina (10 U / ml) como anticoagulante. Se recogió sangre de voluntarios adultos sanos por venopunción. Todos los experimentos se realizaron bajo la aprobación del Comité de Bioética de la Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
2. Dejar 2 ml de dextrano al 6% T500 en PBS en un tubo de 15 ml de centrífuga cónico y añadir 10 ml de sangre. Mezclar invirtiendo el tubo dos o tres veces y se deja reposar durante 45 minutos para permitir la sedimentación de eritrocitos.
3. En un nuevo máximo de 15 ml tubo de centrífuga cónico poner 5 ml de Ficoll-Paque.
4. Tome el plasma rico en leucocitos que se formó encima de los eritrocitos sedimentados, y cuidadosamente la pipeta en la parte superior de la Ficoll-Paque formar una segunda capa. Asegúrese de que hay dos fases.
5. Centrifugar a 516 xg durante 20 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, en la interfase de plasma y Ficoll Paque-existe una capa de células mononucleares. Nordesteutrophils están en la parte inferior del tubo.
6. Eliminar el sobrenadante, el sedimento celular romper tocando el tubo contra un bastidor, y resuspender las células mediante la adición de 10 ml de frío (4 ° C) PBS Nota:. Resuspender las células pipeteando arriba y abajo no es recomendable, ya que esto es demasiado dañar a las células.
7. Transferir la suspensión celular a un tubo de 50 ml cónicos de centrífuga y centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C.
8. Romper el pellet de células como antes y añadir 10 ml de frío (4 ° C) con una solución hipotónica (0,2% de NaCl, 1% de BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) para lisar los eritrocitos. Mezclar por el tubo suavemente con la mano durante exactamente un minuto.
9. Añadir 10 ml de frío (4 ° C) solución hipertónica (1,6% de NaCl, 1% de BSA, 20 mM de HEPES, pH = 7,4), se mezcla y se cuentan las células usando un hemocitómetro (generalmente> 95% son PMN).
   Nota: Mantener el tubo con la suspensión de células en hielo mientras contando las células.
10. Se centrifuga como antes y se resuspende en 10 PMN7 células / ml en frío (4 ° C) PBS. Mantenga en hielo.
    Nota: Los neutrófilos siendo viable y funcional a 4 ° C durante aproximadamente 6 a 8 horas.

2. La activación de PMN

1. Poner 100 l de suspensión de PMN (1 x 10 ⁷ células / ml) en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
   Nota: Los tubos de muestra se debe hacer por lo menos por duplicado. Habituales controles negativos deben incluir sólo primer anticuerpo, y el anticuerpo secundario solamente.
2. Añadir el anticuerpo del receptor anti-integrina correspondiente o anti-Fc monoclonal (mAb) a 10 ug / ml y se incuba en hielo durante 15 min.
3. Lavar PMN por la adición de 1 ml de frío (4 ° C) PBS, centrifugar a 1.743 xg (4.500 rpm) en una microcentrífuga, y aspirar el sobrenadante.
4. Romper el sedimento celular tocando el fondo del tubo contra un bastidor, añadir 1 ml de PBS frío, y se lava dos veces más como en el paso anterior.
   Nota: Estos lavados eliminar el anticuerpo no unido.
5. Resuspender PMN en el mismo (enitial) volumen de tibia (37 ° C) PBS que contenía 60 mg / ml de F (ab ') 2 de cabra anti-IgG de ratón.
   Nota: El anticuerpo secundario anti-ratón de anticuerpos IgG se une a la primera anticuerpo anti-receptor y causa la reticulación del receptor.
6. Incubar a 37 ° C durante 1 a 20 minutos, dependiendo del factor nuclear de interés. Para NF-kB por lo general 15 min, y para Elk-1 generalmente 5 min.
   Nota: incubar las células a 37 ° C entrecruzamiento del receptor induce, que no puede tener lugar a 4 ° C.
7. Añadir 1 ml de PBS frío y centrifugar 3 min a 1.743 xg en microcentrífuga.
8. Remover el sobrenadante
9. Congelar PMN inmediatamente en un baño de dry-ice/ethanol y mantenerlos allí durante 10 minutos.

3. El aislamiento y la fijación de los núcleos

1. Resuspender pellet congelado PMN en 100 l frío (4 ° C) tampón hipotónico (HEPES 10 mM, 10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl _2, y 1 mM recién añadido _{DL-ditiotreitol} [DTT]; PH = 7,9). Se recomienda tomar los tubos del baño de dry-ice/ethanol uno por uno, y para limpiar la parte inferior del tubo antes de añadir el tampón hipotónico.
2. Colocar sobre hielo, y comprobar la integridad de los núcleos mediante la tinción de una parte alícuota de la suspensión de núcleos con azul de tripano. Núcleos mirar a su alrededor y azul. PMN sin avería no mancharse, y los restos celulares aparece como partículas azules de forma irregular.
   Nota: Si suspensión de núcleos contiene muchas células intactas o desechos, es mejor desechar la preparación y repetir el procedimiento con otra muestra.
3. Centrifugar los núcleos a 775 xg (3.000 rpm) en microcentrífuga durante 10 min en el interior de una habitación fría. En este punto los núcleos están muy frágil y cuidado adicional debe ser tomado en mantener las muestras frías y no centrifugar a fuerzas excesivas.
4. Eliminar el sobrenadante por pipeteo muy cuidadoso.
5. Añadir 100 l de paraformaldehído al 4% frío en PBS para fijar los núcleos.
   Nota: El sedimento es muy aflojar unad adición del tampón es suficiente para volver a suspender los núcleos. Pipeteando arriba y abajo debe ser evitado.
6. Incubar en hielo durante 20 min.
7. Inmunomarcador núcleos para citometría de flujo o mantenerlos durante un máximo de 24 horas a 4 ° C.

4. Núcleos inmunomarcación para el análisis de citometría de flujo

1. Centrifugar los núcleos a 1.743 xg (4.500 rpm) en microcentrífuga durante 1 min, y eliminar el sobrenadante mediante pipeteo muy suave.
2. Añadir 100 l de frío (4 º C) 0,1% de Triton X-100, 4% de paraformaldehído en PBS para permeabilizar núcleos. Incubar en hielo durante 10 min.
3. Centrífuga permeabilized núcleos a 1.743 xg en microcentrífuga y retire con cuidado el sobrenadante. En este punto gránulos de núcleos no se adhieren bien en la parte inferior del tubo. Se recomienda centrifugar de nuevo si el sedimento se suelta.
4. Resuspender los núcleos en 500 l de frío 4% de suero fetal bovino (FBS) en PBS para bloquear sitios de unión inespecíficos, e incubar en hielo durante 20 min. Centrífugonúcleos a 1.743 xg durante 3 minutos en microcentrífuga y retire con cuidado el sobrenadante.
5. Resuspender los núcleos en 100 l de PBS frío que contenía 4% de FBS y 2,5 g / ml del mAb contra el factor nuclear de interés. Incubar en hielo durante 20 min.
   Nota: habituales controles negativos deben incluir anticuerpos antinucleares único factor, y sólo marcado con FITC anticuerpo secundario.
6. Lavar dos veces con 500 l de PBS frío con FBS al 4% y centrifugando a 1743 xg durante 3 min.
7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente, los núcleos se resuspende en 100 l de PBS frío que contenía 4% de FBS y 10 ug / ml de la correspondiente marcado con FITC anticuerpo secundario, y se incuba en hielo durante 20 min.
8. Lavar dos veces con 500 núcleos l de PBS frío con FBS al 4%, como en el paso anterior.
9. Resuspender los núcleos en 400 l de paraformaldehído al 4% frío en PBS.
   Nota: Los núcleos se colocan en paraformaldehído al permitir que la muestra se almacena por varios días sin contaminaciónproblemas que pueden ocurrir en presencia de suero.
10. Analizar mediante citometría de flujo inmediatamente o almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de tres días.

5. Análisis de citometría de flujo

1. Analizar núcleos inmunomarcadas en un citómetro de flujo tal FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) o aparato similar.
2. Ajustar la configuración de adquisición para: FSC en escala logarítmica con 10-1, SSC en escala logarítmica en el 196, y los núcleos puerta en un punto de parcelas.
3. Adquirir diez mil núcleos por muestra.
4. Analizar la fluorescencia de FITC núcleos teñidos por el canal FL-1 (506 nm), fijado en escala logarítmica en 400.

Resultados

El método de purificación descrito aquí proporciona generalmente los neutrófilos no estimulados (PMN) con una pureza mayor que 95% (Figura 1A). Aislado PMN entonces puede ser estimulado por los receptores de reticulación particular con anticuerpos monoclonales específicos. Hemos PMN estimulados a través de los receptores Fc y las integrinas (Figura 1B). Una vez estimulado, PMN son lisadas y los núcleos se aislaron con rendimientos altos. Los núcleos son entonces immunolabeled p...

Discusión

El método de purificación descrito aquí permite el aislamiento de neutrófilos no estimulados (PMN) con una pureza mayor que 95% (evaluado por observación microscópica), en un corto tiempo. A veces, los neutrófilos pueden estar contaminados por los eritrocitos, si éste no se lisan completamente. Esto no suele afectar a la técnica, ya que los eritrocitos y los PMN se pueden distinguir fácilmente como poblaciones celulares distintas por citometría de flujo. Aislado PMN entonces puede ser estimulado por los recep...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur