Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Resumo

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue. Os neutrófilos possuem funções transcricionalmente regulados tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Estas funções podem ser estudadas com o método aqui apresentado, o que permite a detecção e quantificação dos factores nucleares por citometria de fluxo em núcleos isolados

Resumo

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico. Estas células são os primeiros a aparecer nos locais de inflamação e à infecção, tornando-se a primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Os neutrófilos possuem importantes funções antimicrobianas, tais como fagocitose, a libertação de enzimas líticas e produção de espécies reactivas de oxigénio. Em adição às funções de defesa importantes, os neutrófilos realizar outras tarefas, em resposta à infecção, tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Citocinas recrutar outros leucócitos que ajudam a eliminar a infecção, e a inibição da apoptose permite que o neutrófilo de viver mais tempo no local da infecção. Estas funções são reguladas ao nível da transcrição. No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com métodos convencionais de gene repórter já que não há eficientes para técnicas de transfecção de neutrófilos. Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar puros a partir de neutrófilos de sangue periférico humano, estimular estas células com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo. O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB e Elk-1 factores nucleares de núcleos a partir de neutrófilos e de outros tipos de células. Assim, este método representa uma opção para a análise de activação de factores de transcrição no núcleo isolado a partir de uma variedade de tipos de células.

Introdução

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico ^1. Durante neutrófilos inflamação e infecção são as primeiras células a aparecer no local afetado, onde eles agem como a primeira linha de defesa ^2. Neutrófilos possuem vários mecanismos, incluindo antimicrobianos ³ fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de enzimas líticas pela degranulação e produção de citocinas pró-inflamatórias ^4,5. Os neutrófilos são células de curta duração que são rapidamente ativadas através de sinalização de receptores de superfície vários celulares. Embora os neutrófilos foram consideradas células de terminal, devido à sua curta vida e porque eles sofrem apoptose, a menos que activada durante o processo inflamatório ^6, é agora evidente que pode também modificar o seu fenótipo, alterando o nível de transcrição de genes específicos. A produção de citocinas ⁵ e a inibição da apoptose ^7,8 são dois important funções de activação dependentes de células reguladas ao nível da transcrição dos neutrófilos. Factor nuclear kB (NF-kB) participa no controlo transcricional da produção de citoquina e ⁴ na regulação da sobrevivência celular e apoptose ^9-11 em vários tipos de células.

As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são estudados por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética turno (EMSA). No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com os ensaios de gene repórter, uma vez que não existem técnicas eficazes para a transfecção de neutrófilos. Ensaios de EMSA foram usados ​​em neutrófilos para explorar activação do factor nuclear ^12,13, no entanto, esta metodologia é complicada e dispendiosa uma vez que envolve a utilização de material radioactivo. Nucleofection é uma outra técnica que tem sido utilizada successfully para transfectar monócitos ^14. Assim, pelo menos em teoria, a activação do factor nuclear pode ser detectado nos neutrófilos por transfecção (apesar de baixa eficiência). No entanto, esta técnica poderia ser mais dispendioso, demorado e provavelmente menos quantitativo. A análise microscópica de células imunomarcadas também poderia ser usado para detectar factores nucleares no núcleo. Com efeito, temos detectado translocação de NF-kB para o núcleo deste modo ^15. Infelizmente, esta técnica também é demorada, menos quantitativos, e sujeita a viés do observador.

Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico humano, estimular estas células via integrinas ou receptores de Fc com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo (Figura 1). O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB ¹⁵ e Elk-1 ¹⁶ factores nucleares de núcleos de neutrófilos. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear no núcleo. Este método também pode ser utilizado para analisar o nível de factores de transcrição no núcleo de outros tipos de células.

Protocolo

1. Isolamento de Neutrófilos (PMN) a partir de Sangue Humano

1. Usar cerca de 20 ml de sangue humano com heparina (10 U / ml) como anti-coagulante. O sangue foi coletado de voluntários adultos saudáveis ​​por venopuntura. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação da Comissão de Bioética no Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
2. Coloque 2 ml de 6% de dextrana T500 em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar 10 ml de sangue. Misturar invertendo o tubo de duas ou três vezes e deixar repousar durante 45 minutos para permitir a sedimentação de eritrócitos.
3. Num tubo de centrífuga de fresco 15 mL cónico colocar 5 ml de Ficoll-Paque.
4. Levar o plasma rico em leucócitos que se formou por cima eritrócitos sedimentados, e cuidadosamente pipetar-o em cima do Ficoll-Paque formar uma segunda camada. Certifique-se de duas fases.
5. Centrifugar a 516 xg durante 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, a interfase de plasma e de Ficoll-Paque, há uma camada de células mononucleares. Neutrophils estão na parte inferior do tubo.
6. Elimine o sobrenadante, romper o pellet celular tocando o tubo contra uma prateleira, e ressuspender as células por adição de 10 ml de frio (4 ° C) Nota PBS:. Ressuspender as células pipetando para cima e para baixo não é recomendada uma vez que este está demasiado prejudiciais para as células.
7. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C.
8. Quebrar o sedimento de células, como antes e adicionam-se 10 ml de frio (4 ° C) uma solução hipotónica (0,2% de NaCl, 1% de BSA, Hepes 20 mM, pH = 7,4) para lisar os eritrócitos. Misture agitando o tubo suavemente com a mão por exatamente um minuto.
9. Adicionar 10 ml de frio (4 ° C) a solução hipertónica (1,6% de NaCl, 1% de BSA, HEPES 20 mM, pH = 7,4), misturar e contar as células utilizando um hemocitómetro (geralmente> 95% são PMN).
   Nota: Mantenha o tubo com a suspensão de células sobre gelo durante a contagem de células.
10. Centrifugar como antes e ressuspender PMN em 107 células / ml em frio (4 ° C) PBS. Manter em gelo.
    Nota: Os neutrófilos permanecer viável e funcional, a 4 ° C durante cerca de 6 a 8 horas.

2. Ativando PMN

1. Coloque 100 ul de suspensão de PMN (1 x 10 ⁷ células / ml) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml.
   Nota: os tubos de amostras deve ser feito pelo menos em duplicata. Habituais controles negativos deve incluir primeiro anticorpo somente, e anticorpo secundário.
2. Adicionar o anticorpo para o receptor anti-integrina correspondente ou anti-Fc de anticorpo monoclonal (mAb) a 10 ng / ml e incuba-se em gelo durante 15 min.
3. Lavar PMN por adição de 1 ml de frio (4 ° C) PBS, centrifugação a 1743 xg (4500 rpm) numa microcentrífuga, e aspiração do sobrenadante.
4. Romper o pellet celular tocando no fundo do tubo contra um rack, adicionar 1 ml de PBS frio, e lavar mais duas vezes como no passo anterior.
   Nota: Estes lava remover o anticorpo não ligado.
5. Ressuspender PMN na mesma (emvolume) mador inicial de água morna (37 ° C) de PBS contendo 60 ug / ml de F (ab ') 2 de cabra anti-IgG de ratinho.
   Nota: O anticorpo secundário anti-rato IgG que se ligam ao anticorpo anti-receptor da primeira e fará com que a reticulação do receptor.
6. Incubar a 37 ° C durante 1 a 20 minutos, dependendo do factor nuclear de interesse. Por min geralmente NF-kB 15, e para Elk-1 geralmente 5 min.
   Nota: A incubação das células a 37 ° C reticulação do receptor induz, que não pode ter lugar a 4 ° C.
7. Adicionar 1 ml de PBS frio e centrifugar 3 min a 1743 xg em microcentrífuga.
8. Remover o sobrenadante
9. PMN congelar imediatamente em banho dry-ice/ethanol e mantê-los lá por 10 min.

3. Isolamento e Fixação de Núcleos

1. Ressuspender o pellet congelado PMN em 100 ul de frio (4 ° C) de tampão hipotónico (10 mM HEPES, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl _2, e 1 mM frescamente agregado _{DL-ditiotreitol} [DTT], PH = 7,9). Recomenda-se a levar os tubos fora do banho dry-ice/ethanol um por um, e para limpar a parte inferior do tubo, antes de adicionar o tampão hipotónico.
2. Colocar em gelo, e verificar a integridade núcleos por coloração de uma aliquota da suspensão de núcleos com azul de tripano. Núcleos de olhar em volta e azul. PMN intacto não ficam manchadas e os detritos de célula aparece como partículas azuis de forma irregular.
   Nota: Se a suspensão contém muitos núcleos de células intactas ou fragmentos, é melhor para descartar a preparação e repetir o procedimento com outra amostra.
3. Centrifugar a 775 xg núcleos (3000 rpm) em microcentrífuga durante 10 minutos dentro de uma câmara fria. Neste ponto são núcleos de atendimento muito frágeis e devem ser levados em manter as amostras frio e não centrifugação a forças excessivas.
4. Remover o sobrenadante por pipetagem muito cuidado.
5. Adicionar 100 uL de paraformaldeído a 4% em PBS frio para fixar núcleos.
   Nota: O sedimento é muito solta umd adicionando o tampão é suficiente para ressuspender os núcleos. Pipetando para cima e para baixo, deve ser evitada.
6. Incubar em gelo durante 20 min.
7. Immunolabel núcleos por citometria de fluxo, ou mantê-los durante até 24 horas a 4 ° C.

4. Imunomarcação Núcleos de Análise de Citometria de Fluxo

1. Centrifugar a 1.743 xg núcleos (4500 rpm) em microcentrífuga durante 1 minuto, e remover o sobrenadante por pipetagem suave muito.
2. Adicionar 100 ul de frio (4 ° C) 0,1% de Triton X-100, paraformaldeído a 4% em PBS para permeabilizar núcleos. Incubar em gelo durante 10 min.
3. Centrífuga permeabilizadas núcleos em 1743 xg em microcentrífuga e remova cuidadosamente o sobrenadante. Neste ponto, os núcleos aglomerados não atribuem bem na parte inferior do tubo. Recomenda-se a centrifugar de novo se o sedimento se solta.
4. Núcleos ressuspender em 500 ul de frio de 4% de soro fetal bovino (FBS) em PBS para bloquear locais de ligação não específicos, e incubar em gelo durante 20 min. Centrifugadornúcleos em 1743 xg durante 3 minutos em microcentrifuga e remover cuidadosamente o sobrenadante.
5. Ressuspender núcleos em 100 ul de PBS frio contendo 4% de FBS e 2,5 ng / ml do mAb contra o factor nuclear de interesse. Incubar em gelo durante 20 min.
   Nota: Usual controlos negativos devem incluir anti-nuclear anticorpo único factor, e FITC marcado com anticorpo secundário apenas.
6. Lavar duas vezes com 500 ul de PBS frio com 4% de FBS e centrifugação a 1743 xg durante 3 min.
7. Remover o sobrenadante cuidadosamente, núcleos ressuspender em 100 ul de PBS frio contendo 4% de FBS e 10 ng / ml de anticorpo marcado com FITC derivado correspondente, e incubar em gelo durante 20 min.
8. Lave os núcleos duas vezes com 500 ul de PBS frio com FBS a 4% como no passo anterior.
9. Ressuspender núcleos em 400 uL de paraformaldeído a 4% em PBS frio.
   Nota: Os núcleos são colocados em paraformaldeído para permitir que a amostra a ser armazenadas durante vários dias sem contaminaçãoproblemas que podem ocorrer na presença de soro.
10. Analisar por citometria de fluxo imediatamente ou armazenar no escuro a 4 ° C durante um máximo de três dias.

5. Análise por Citometria de Fluxo

1. Analise núcleos immunolabeled num citómetro de fluxo tal FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) ou aparelho semelhante.
2. Ajustar as configurações de aquisição para: FSC no log-balança a 10-1, SSC, log-balança a 196, e núcleos portão em um ponto-enredo.
3. Adquirir 10 mil núcleos por amostra.
4. Analisar a fluorescência do FITC manchado de núcleos através do canal FL-1 (506 nm), fixado em log-balança a 400.

Resultados

O método de purificação descrito aqui fornece geralmente neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (Figura 1A). PMN isolado pode então ser estimulada pelos receptores de reticulação específicos com anticorpos monoclonais específicos. Temos estimulado PMN através de receptores Fc e integrinas (Figura 1B). Uma vez estimulado, PMN são lisadas e os núcleos são isolados com rendimentos elevados. Os núcleos são então immunolabeled para um determinado factor ...

Discussão

O método de purificação descrito aqui permite o isolamento dos neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (avaliada por observação microscópica), num curto período de tempo. Por vezes, os neutrófilos podem ser contaminados por eritrócitos, se este não estiver completamente lisadas. Isso geralmente não afetam a técnica, uma vez que os eritrócitos e PMN pode facilmente ser distinguido como populações de células distintas por citometria de fluxo. PMN isolado pode então ser estimulada pel...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur