Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Özet

Nötrofiller, kan içinde en bol bulunan lökositlerin vardır. Nötrofiller proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi transkripsiyonel düzenlenir fonksiyonları sahip. Bu işlevler izole çekirdeklerinde flow sitometri ile nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlar Burada sunulan yöntem ile ele alınabilir

Özet

Nötrofiller periferik kanda en bol lökosit vardır. Bu hücreler böylece mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olma, inflamasyon ve enfeksiyon sitelerinde görünmesini ilk. Nötrofiller gibi fagositoz, parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve reaktif oksijen türlerinin üretimi gibi önemli antimikrobiyal fonksiyonları sahip. Bu önemli savunma işlevlerine ek olarak, nötrofillerin proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi enfeksiyonuna yanıt olarak diğer görevleri yerine getirir. Sitokinler enfeksiyonu temizlemek yardımcı olan diğer lökositler işe ve apopitoz inhibisyonu nötrofil enfeksiyon yerinde uzun yaşamalarını sağlar. Bu işlevler, transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler çünkü herhangi bir verimli olduğu için Bununla birlikte, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş bir çalışma geleneksel raportör gen yöntemler ile gerçekleştirilemezNötrofil transfeksiyon için cient teknikleri. Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan saf nötrofilleri izole teknikleri tanımlamak, anti-reseptör antikorları ile bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analiz. Yöntem başarılı bir şekilde nötrofiller ve diğer hücre türleri çekirdeklerinde NF-KB ve Elk-1 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, hücre tiplerinde izole edilen çekirdeklerin içinde transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu analiz etmek için bir seçenek oluşturmaktadır.

Giriş

Nötrofiller, periferik kan ^1. en bol bulunan lökositlerin vardır. Inflamasyon ve enfeksiyon nötrofiller sırasında onlar savunma ² ilk satırı olarak hareket nereye etkilenen sitesinde görünmeye ilk hücrelerdir. Nötrofiller fagositoz, reaktif oksijen türlerinin üretimi, degranülasyonu tarafından parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve ^4,5 proinflamatuar sitokinlerin üretimi dahil olmak üzere birçok antimikrobiyal mekanizmaları ³ sahiptirler. Nötrofiller hızla çeşitli hücre yüzey reseptörler aracılığıyla aktif olsun kısa ömürlü hücrelerdir. Nötrofiller, kısa ömrü nedeniyle terminali hücreler sayılır ve inflamatuar süreç ⁶ sırasında aktive sürece apoptoz geçmesi, çünkü onlar da belirli genlerin transkripsiyon düzeyini değiştirerek onların fenotip değiştirebilirsiniz artık açıktır olmasına rağmen. Sitokinler ⁵ ve apoptoz ^{ile 7,8} inhibisyonu üretim iki tanesi important aktivasyonu-bağımlı hücre fonksiyonlarını nötrofillerde transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nükleer faktör kappa B (NF-kB) sitokin üretimi ⁴ transkripsiyonel kontrolü ve hücre canlılığı ve çeşitli hücre tiplerinde apoptoz ^9-11 düzenlenmesinde katılır.

Nükleer faktör aktivasyonu neden sinyal yollarının genellikle muhabir gen deneyleri veya elektroforetik hareketlilik kayma analizi (EMSA) tarafından incelenmiştir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler, çünkü nötrofil transfeksiyon için bir etkili teknikler vardır Bununla beraber, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş çalışması, haberci gen deneyleri ile gerçekleştirilemez. EMSA deneyleri nükleer faktör aktivasyon ^12,13 keşfetmek için nötrofillerin kullanılmış olan, bu radyoaktif maddelerin kullanımı içerir çünkü ancak bu yöntem karmaşık ve pahalıdır. Nucleofection successfu kullanılmış olan diğer bir tekniktirlly monositler ¹⁴ transferinde. Böylece, en azından teoride, nükleer faktör aktivasyonu (düşük verimlilik rağmen) transfeksiyon tarafından nötrofil tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem daha pahalı ve zaman alıcı bir olasılıkla daha az miktar olacaktır. Immunohistokimyasal hücrelerin mikroskopik analiz aynı zamanda çekirdek içinde nükleer faktör tespit etmek için kullanılabilir. Nitekim, biz çekirdeği bu şekilde ¹⁵ içine NF-KB translokasyon tespit ettik. Ne yazık ki, bu tekniğin ayrıca, zaman alıcı az nicel ve gözlemcinin önyargı tabidir.

Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan nötrofillerin izole teknikleri tanımlamak, (F, anti-reseptör antikorları ile integrinler veya Fc reseptörleri aracılığıyla bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analizŞEKIL 1). Yöntem başarılı bir NF-KB ¹⁵ ve nötrofil çekirdekler Elk-1 ¹⁶ nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yöntemin duyarlılığı çekirdek içinde nükleer faktör seviyeleri küçük değişiklikleri algılama izin verir. Bu yöntem ayrıca diğer hücre tipleri arasından çekirdeklerinde transkripsiyon faktörlerinin düzeyini analiz etmek için de kullanılabilir.

Protokol

1. İnsan Kanı gelen Nötrofiller İzolasyonu (PMN)

1. Pıhtılaşma önleyici olarak heparin (10 U / ml) ile 20 ml insan kanı kullanın. Kan venopuncture tarafından sağlıklı yetişkin gönüllüler toplanmıştır. UNAM - Tüm deneyler Instituto de INVESTIGACIONES Biomédicas de Biyoetik Komitesi onayı altında yapılmıştır.
2. 15 ml konik santrifüj tüpü içine PBS içinde% 6 dekstran T500, 2 ml koyun ve kan 10 ml eklenir. Ters tüp ile iki veya üç kez karıştırın ve eritrosit sedimantasyon için izin vermek için 45 dakika bekletin.
3. Taze bir 15 ml konik santrifüj tüpünde 5 ml Ficoll-Paque koydu.
4. Sedimanlaşmış eritrositler üzerinde oluştuğunu lökosit zengin plazma alın ve dikkatlice ikinci bir katman oluşturan Ficoll-Paque üstüne Pipeti. Iki faz vardır emin olun.
5. 4 ° C'de 20 dakika süre ile 516 x g'de santrifüjleyin Santrifüjlemeden sonra, plazma ve Ficoll-Paque bir ara yüzeyinde mononükleer hücrelerin bir tabakası vardır. Neutrophils tüpün alt tarafında yer alır.
6. Süpernatant ortadan kaldırır, bir raf karşı tüp dokunarak hücre peleti kırmak ve 10 ml soğuk (4 ° C) PBS Not eklenerek hücrelerin tekrar süspansiyon:. Yukarı pipetleme hücreleri resuspending ve bu da olduğu aşağı tavsiye edilmez hücrelere zarar.
7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 290 xg'de 50 ml konik santrifüj tüpü ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın
8. Daha önce olduğu gibi hücre peleti kırmak ve 10 mL soğuk (4 ° C), eritrositlerin lyse hipotonik çözelti (% 0.2 NaCl,% 1 BSA, 20 mM Hepes, pH = 7.4) ekleyin. Tam bir dakika boyunca elle tüpü yavaşça dönen çevirerek karıştırın.
9. 10 ml soğuk (4 ° C) hipertonik çözelti (% 1.6 NaCl,% 1 BSA, 20 mM Hepes, pH değeri = 7.4) karışımı ve bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı (genellikle>% 95 PMN vardır). Ekleme
   Not: hücrelerin sayılması sırasında buz üzerinde hücre süspansiyonu ile tüp tutun.
10. Daha önce olduğu gibi santrifüjden sonra tekrar süspansiyon 10 PMNSoğuk 7 hücre / ml (4 ° C) PBS ile yıkandı. Buz üzerinde tutun.
    Not: Nötrofiller 4 de yaşatılabilir ve işlevsel kalır yaklaşık 6 ila 8 saat boyunca ° C.

2. PMN etkinleştirilmesi

1. 100 PMN süspansiyon ul (1 x 10 ⁷ hücre / ml) 1.5 ml Eppendorf tüp içine koymalısınız.
   Not: Örnek tüpleri en azından çiftleri halinde yapılmalıdır. Olağan negatif kontroller yalnızca ilk antikor ve sekonder antikor içermelidir.
2. 10 ug / ml 'de karşılık gelen anti-integrin ya da anti-Fc reseptörü monoklonal antikor (mAb) ekleyin ve 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edilir.
3. 1 ml soğuk (4 ° C) PBS, bir mikrosantrifüj içinde 1,743 x g'de (4500 rpm) santrifüje tabi tutarak, ve süpernatan aspire. Eklenmesi ile yıkayın PMN
4. Bir raf karşı tüpün alt dokunarak hücre peleti Break, 1 ml soğuk PBS ekleyin ve iki kez daha, önceki adımda olduğu gibi yıkayın.
   Not: Bu ilişkisiz antikor kaldırmak yıkar.
5. Aynı süspanse PMN (inılık itial) hacim (37 ° C) PBS F 60 ug / ml (ab ') 2 keçi anti-fare IgG içeren.
   Not: ikincil anti-fare IgG antikoru ilk anti-reseptör antikor bağlanacaktır ve reseptör ile çapraz neden olur.
6. İlgi nükleer faktör bağlı olarak 1 ila 20 dakika, 37 ° C'de inkübe edin. NF-KB, genellikle 15 dakika için, ve genellikle Elk-1 5 dak.
   Not: 37 hücreleri inkübe 4 yer alamaz ° C baskılanması reseptör çapraz, ° C
7. 1 ml soğuk PBS ekleyin ve mikrosantrifüj yılında 1.743 x g'de 3 dakika santrifüj.
8. Süpernatantı
9. Dry-ice/ethanol banyosunda hemen PMN ve 10 dakika boyunca onları orada tutmak dondurun.

3. Çekirdeğin İzolasyon ve Fiksasyon

1. 100 ul soğuk içinde süspanse dondurulmuş PMN pellet (4 ° C), hipotonik tampon maddesi (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 _{mM MgCl2,} ve 1 mM taze katma _{DL-ditiyotretol} [DTT]; PH = 7.9). Bu bir tarafından dry-ice/ethanol banyo biri tüp çıkarmak için, ve hipotonik tampon eklemeden önce tüpün alt silin tavsiye edilir.
2. Buz üzerine yerleştirin ve tripan mavisi ile çekirdeklerin süspansiyonu bir kısım boyanarak çekirdeklerin bütünlüğünü kontrol edin. Çekirdekler yuvarlak ve mavi görünüyor. Bozulmamış PMN lekeli ve hücre artıkları Düzensiz şekilli mavi parçacıklar olarak görünür alamadım.
   Not: çekirdekler askı birçok sağlam hücreler veya enkaz içeriyorsa, hazırlık atmak ve başka bir örneği ile işlemi tekrarlayın daha iyidir.
3. Soğuk bir oda içinde 10 dakika süreyle mikrosantrifüj 775 xg (3.000 rpm) çekirdekler santrifüjleyin. Bu noktada çekirdekler anda çok kırılgan ve ekstra bakım örnekler soğuk ve aşırı güçler santrifüj değil tutmak alınmalıdır vardır.
4. Çok dikkatli pipetleme tarafından süpernatant çıkarın.
5. Çekirdekler düzeltmek için PBS içinde soğuk% 4 paraformaldehid 100 ul ekleyin.
   Not: pelet çok bir gevşek bird arabellek ekleyerek çekirdekleri tekrar süspansiyon için yeterlidir. Aşağı yukarı pipetleme ve kaçınılmalıdır.
6. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
7. Immunolabel Akım sitometri için çekirdekleri veya 4 yukarı 24 saat için onları tutmak ° C

4. Akım Sitometri Analiz Çekirdekler immün

1. 1 dakika mikrosantrifüj yılında 1,743 xg (4.500 rpm) nükleuslu santrifüjleyin ve çok nazik pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak.
2. 100 ul soğuk (4 ° C)% 0.1 Triton X-100, çekirdeğin geçirgenliği PBS içinde% 4 paraformaldehid. Ekleme 10 dakika buz içinde inkübe edin.
3. Santrifüj mikrosantrifüj yılında 1.743 xg'de nükleuslu permeabilize ve dikkatlice süpernatant kaldırmak. Bu noktada çekirdekler granül tüpün alt kısmında da binmemelidir. Bu pelet gevşek alırsa tekrar santrifüj önerilir.
4. Spesifik olmayan bağlanma yerleri blok, ve 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe soğuk PBS içinde% 4 fetal bovin serumu (FBS), 500 ul içinde süspanse çekirdekleri. Santrifüj1.743 at çekirdekler mikrosantrifüj 3 dakika xg ve dikkatlice süpernatant kaldırmak.
5. 4% FBS ve 2.5 mikrogram / ilgi nükleer faktör karşı mAb ml içeren soğuk PBS 100 ul çekirdekleri tekrar. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   Not: Her zamanki negatif kontrolleri yalnızca anti-nükleer faktör antikoru içerir ve FITC-etiketli sekonder antikoru sadece olmalıdır.
6. 4% FBS ve 3 dk süreyle 1743 xg'de santrifüj ile soğuk PBS 500 ul ile iki kez yıkayın.
7. % 4 FBS ve 10 ug / karşılık gelen ikincil FITC-etiketlenmiş antikor ml'lik soğuk PBS içinde 100 ul, çok dikkatli bir şekilde tekrar süspansiyon çekirdekler süpernatantı, ve 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edilir.
8. Önceki aşamada olduğu gibi% 4 FBS ile soğuk PBS 500 ul ile iki kez çekirdekler yıkayın.
9. PBS içinde soğuk% 4 paraformaldehid 400 ul çekirdekleri tekrar.
   Not: Çekirdek numune kontaminasyonu olmaksızın birkaç gün boyunca saklanır izin verecek şekilde yerleştirilir paraformaldehitserum varlığında meydana gelen sorunlar.
10. Üç gün için 4 de flow sitometri veya karanlıkta mağaza ° C tarafından hemen analiz edin.

5. Akış Sitometri Analizi

1. Veya benzeri cihazlar; akış sitometresinin böyle bir FACScan (Franklin Lakes, NJ Becton Dickinson) olarak immunolabeled çekirdekleri analiz edin.
2. 196 de log-ölçekte SSC ve bir nokta-arsa kapısı çekirdekleri, 10-1 de log-ölçekte FSC:, satın alma ayarları yapın.
3. Numune başına on bin çekirdekler edinin.
4. 400 log-ölçekte belirlenen FL-1 kanal (506 nm) ile FITC-lekeli çekirdeklerin floresans analiz.

Sonuçlar

Saflaştırma yöntemi burada açıklanan genellikle% 95 (Şekil 1A) daha büyük saflık ile uyarılmamış nötrofiller (PMN) sağlar. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stimüle edilebilir. Biz Fc reseptörleri ve integrinler (Şekil 1B) ile PMN canlandırmıştır. Bir kez uyarılan PMN lize ve çekirdekler yüksek verimle izole edilmektedir. Çekirdekler sonra bu özel antikorlar ile nükleer faktör kappa B (NF-KB)

Tartışmalar

Burada anlatılan arınma yöntemi kısa bir süre içinde% 95 (mikroskobik gözlem yoluyla belirlenmiştir), daha yüksek saflıkta uyarılmamış nötrofillerin izolasyonu (PMN) verir. İkincisi tamamen lize değilseniz Bazen nötrofiller eritrositler kirlenmiş olabilir. Eritrositler ve PMN kolayca flow sitometri ile farklı hücre popülasyonlarının olarak ayırt edilebilir çünkü bu, genellikle, teknik etkilemez. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stim?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur