一种简单有效的方法，通过流式细胞仪检测核转录因子激活人体中性粒细胞

摘要

中性粒细胞是白细胞在血液中含量最丰富的。中性粒细胞具有转录调控功能，如生产的炎性细胞因子和抑制细胞凋亡。这些函数可以用这里介绍的方法，它允许核因素，通过流式细胞术检测和定量在孤立的核研究

摘要

中性粒细胞是最丰富的外周血白细胞。这些细胞是第一次出现在炎症和感染的网站，从而成为第一线的防御入侵的微生物。中性粒细胞具有重要的抗菌功能的吞噬作用，细胞溶解酶的释放，生产的活性氧等。除了这些重要的防御功能，中性粒细胞生产的炎性细胞因子和细胞凋亡的抑制感染，如执行其他任务。细胞因子招募其他的白细胞，帮助清除感染和抑制细胞凋亡，使中性粒细胞在受感染的网站活的时间更长。这些功能是在转录水平的调节。但是，由于中性粒细胞是短命的细胞，在这些细胞中的转录调控的响应研究不能进行与传统的报告基因的方法，因为没有效率cient中性粒细胞转染技术。在这里，我们提出了一个简单而有效的方法，它允许在孤立和immunolabeled的核的流式细胞仪检测和定量的核因子。我们描述的技术来隔离纯粹从人外周血中性粒细胞，刺激这些细胞与抗受体抗体，隔离和immunolabel核，并用流式细胞仪分析核。该方法已成功地用于检测NF-κB和核因子Elk-1的中性粒细胞和其他类型细胞的细胞核中。因此，这种方法代表一个选项用于分析从多种类型的细胞在孤立的核转录因子的激活。

引言

中性粒细胞是最丰富的外周血中的白细胞^1。在炎症和感染过程中嗜中性粒细胞是出现在受影响的部位，在那里他们作为防御²的第一行的第一个细胞。中性粒细胞具有几种抗菌^机制的吞噬能力，生产的活性氧的溶解酶脱颗粒，释放和生产，促炎细胞因子^4,5。中性粒细胞是短命的细胞得到迅速激活，通过从不同的细胞表面受体的信号。虽然中性粒细胞被认为是终末细胞，由于其短暂的一生，因为它们发生细胞凋亡，除非激活在炎症过程，它现在很清楚，他们也可以修改他们的表型改变特定基因的转录水平。生产的细胞因子⁵和抑制凋亡^7,8两个important活化依赖的细胞功能调节在嗜中性粒细胞中的转录水平。核因子κB（NF-κB）参与细胞因子的生产^4，在调节细胞的存活和凋亡^9-11在各种细胞类型中的转录控制。

导致核因子激活的信号通路研究报告基因检测或电泳迁移率分析（EMSA）。但是，由于中性粒细胞是短命的细胞，在这些细胞中的转录调控的响应研究不能进行与报告基因检测中，因为不存在有效的中性粒细胞转染技术。 EMSA分析已被用于在嗜中性粒细胞，探讨核因子活化^12,13，然而，这种方法是复杂和昂贵的，因为它涉及使用放射性物质。核转染是另一种技术，已被用于成功。LLY转染单核细胞^14。因此，至少在理论上，核因子的活化可以在中性粒细胞通过转染检测（尽管效率低）。然而，该技术将更加昂贵，耗时的和可能不太定量。在细胞核中，也可用于免疫染色的细胞的显微分析检测核因素。事实上，我们已检测NF-κB的易位到细胞核中这种方式^15。不幸的是，这种技术也是耗时，量变少，和受观察员的偏置。

在这里，我们提出了一个简单而有效的方法，它允许在孤立和immunolabeled的核的流式细胞仪检测和定量的核因子。我们描述技术从人外周血中分离出中性粒细胞，刺激这些细胞通过整合或Fc受体的抗受体抗体，隔离和immunolabel核，并通过流式细胞仪分析核（FIGURE 1）。该方法已成功地用于检测NF-κB和Elk-1的^16个核因子中性粒细胞的细胞核。了该方法的灵敏度允许在细胞核中的核因子水平的小的变化的检测。此方法也可用于从其他类型的细胞的核转录因子分析的水平。

研究方案

1。从人血中分离中性粒细胞（PMN）

1. 约20毫升人体血液中作为抗凝血剂肝素（10 U / ml）的使用。从健康成年志愿者venopuncture采集血液。所有的实验都做生物伦理委员会在研究所德Investigaciones的Biomédicas - 墨西哥国立自治大学的批准下。
2. 将2毫升在PBS中的6％葡聚糖T500到15毫升锥形离心管中，并加入10毫升的血液。颠倒试管混合两次或三次，并让它坐45分钟，以允许血沉。
3. 在一个新的15毫升锥形离心管中，将5毫升的Ficoll-Paque联合应用。
4. 以富含白细胞的血浆上方形成沉淀的红细胞，并仔细吸取试剂的Ficoll-Paque联合形成的第二层的顶部上。确保有两个阶段。
5. 在4℃下离心20分钟，在516×g离心离心分离后，在血浆和Ficoll-Paque的相间有单核细胞的层。氖在试管底部utrophils是。
6. 消除上清液，通过轻敲管针对机架打破细胞沉淀，重悬细胞，加入10毫升冷的（4℃）的PBS。 注:重悬细胞通过上下吹打不推荐使用，因为这是太破坏细胞。
7. 细胞悬浮液转移到50毫升锥形离心管中，离心，在290×g离心5分钟，在4℃下
8. 如前额的细胞沉淀，并加入10毫升冷的（4℃）低渗溶液（0.2％的NaCl，1％BSA的20mM的Hepes，pH值= 7.4），以溶解红细胞。混合管用手轻轻摇晃了整整一分钟。
9. 加入10毫升冷的（4℃）高渗溶液（1.6％的NaCl，1％BSA的20mM HEPES，pH值= 7.4），混合，并计数细胞用血细胞计数器（通常> 95％是中性粒细胞）。
   注意:保持冰的细胞计数管的细胞悬液。
10. 像以前那样离心，重悬在10 PMN7细胞/毫升在低温（4℃）PBS。请在冰上。
    注:嗜中性粒细胞仍然可行的和功能性的，在4℃下进行约6〜8小时。

2。激活中性粒细胞

1. 将100μl的PMN悬浮液（1×10 ^7个细胞/ ml）至1.5 ml Eppendorf管中。
   注:样品管，应该至少一式两份。通常阴性对照应该包括:第一的抗体只，和二次抗体。
2. 添加相应的抗integrin或抗Fc受体的单克隆抗体（mAb），10微克/毫升，并在冰上孵育15分钟。
3. 通过加入1毫升的冷（4℃）PBS中，于1,743 xg离心（4,500 rpm转速）在离心的离心，吸取上清液。洗净PMN的
4. 额攻丝针对机架的底部的管，将细胞沉淀，加入1ml冷的PBS中，洗2次以上，在前面的步骤。
   注意:这些洗涤除去未结合的抗体。
5. 重悬相同（PMNitial）量的温水（37°C）PBS含60μg/ ml的F（AB'）2的羊抗鼠IgG。
   注:的二次抗小鼠IgG抗体将结合到第一抗受体抗体，将导致该受体的交联。
6. 在37℃下孵育1至20分钟，这取决于对核因子的权益。 NF-κB的通常为15分钟，和Elk-1的通常为5分钟。
   注:孵化的细胞在37℃下诱导受体交联，这是不可能发生的，在4℃下
7. 加入1ml冷PBS，并在1743 XG中的微量离心3分钟。
8. 除去上清液
9. 冻结PMN立即在dry-ice/ethanol浴，让他们有10分钟。

3。隔离和固定的核

1. 冷冻中性粒细胞沉淀重悬在100μl冷（4℃）的低渗缓冲液（10mM的HEPES，10 mM KCl中，1.5毫摩尔MgCl _2，和 1 mM的新鲜增值_DL-二硫苏糖醇（DTT），pH值= 7.9）。建议采取管满分在dry-ice/ethanol浴一步法由一个，并加入低渗缓冲液之前，擦拭干净的试管底部。
2. 置于冰上，并检查核完整的细胞核悬浮液用台盼蓝染色的等分。核举目四顾，蓝色。完整的中性粒细胞被染色，并显示为蓝色颗粒形状不规则的细胞碎片。
   注:如果细胞核悬浮液中含有许多完整的细胞或碎片，最好是放弃的准备和与其它样本重复上述步骤。
3. 离心机核在775 XG（3000转）的微量离心10分钟，寒冷的房间内。在这一点上核是很脆弱的，格外小心，应采取冷的样品，而不是在过大的力离心。
4. 除去上清液非常小心的移液。
5. 加入100μl冷的4％多聚甲醛固定核。
   注:颗粒是非常松散的D添加缓冲液是足够的重悬细胞核。上下吹打应加以避免。
6. 在冰上孵育20分钟。
7. immunolabel原子核用于流式细胞仪，或将其维持长达24小时，在4℃下

4。核应用免疫流式细胞仪分析

1. 离心1743的XG（4500转），原子核的离心1分钟，然后取出上清液很温柔的移液。
2. 加入100μl的冷（4℃），0.1％的Triton X-100，在PBS中的4％多聚甲醛透性核。在冰中孵育10分钟。
3. 在1743 XG中的微量离心机透核，小心地取出上清液。此时细胞核粒料不附加在试管底部。建议再次离心，沉淀得到宽松。
4. 重悬细胞核在500μl的冷的4％牛胎儿血清（FBS）在PBS中，以阻断非特异性结合位点，并在冰上孵育20分钟。离心分离原子核在1743 XG的离心3分钟，小心地取出上清液。
5. 重悬在100μl冷PBS含4％FBS和2.5微克/毫升的单克隆抗体对核因子的利息的原子核。在冰上孵育20分钟。
   注:常住阴性对照只应包括抗核因子抗体，FITC标记的二次抗体只。
6. 用500μl冷的PBS洗两次，用4％的FBS和在1743×g离心3分钟离心。
7. 非常小心除去上清液，重悬核在冷PBS100μl的含有4％FBS和10微克/毫升，相应的FITC-标记的第二抗体，并在冰上孵育20分钟。
8. 用500μl的冷PBS洗净细胞核两次与4％的FBS，如在前面的步骤。
9. 重悬在400μl的冷的4％多聚甲醛的PBS中的原子核。
   注:核被放置在多聚甲醛，让样品数天而不会受到污染，被存储血清的存在下，在可能发生的问题。
10. 分析立即用流式细胞仪或存放在黑暗中，在4°C长达三天。

5。流式细胞仪分析

1. 分析immunolabeled核流式细胞仪在FACScan（Becton Dickinson公司，新泽西州富兰克林湖）或类似的设备。
2. 调整收购的设置，在日志规模在10-1:FSC，SSC在日志规模在196和栅极核点图。
3. 采集每个样品10000核。
4. 通过分析FITC染色的细胞核的荧光FL-1通道（506 nm）的日志规模在400。

结果

这里所描述的纯化方法通常提供未受刺激的嗜中性粒细胞（PMN）的纯度大于95％（ 图1A）。隔离PMN然后，可以通过交联的特定受体的特异性单克隆抗体的刺激。我们已刺激的PMN通过Fc受体和整合（ 图1B）。一旦受到刺激，中性粒细胞裂解和细胞核被隔离，产量高。细胞核，然后为一个特定的核转录因子核因子κB（NF-κB），与特定的抗体（ 图1B），如immunolabeled?...

讨论

这里所描述的纯化方法允许隔离未受刺激的嗜中性粒细胞（PMN）的纯度大于95％（通过显微镜观察评估），在很短的时间。有时，中性粒细胞被污染的红细胞，如果后者不完全溶解。通常这并不影响技术，通过流式细胞仪检测，因为红细胞和中性粒细胞可以很容易地被区分为不同的细胞群。隔离PMN然后，可以通过交联的特定受体的特异性单克隆抗体的刺激。事实上，中性粒细胞也可以被刺激的药?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur