유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

요약

호중구는 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등 transcriptionally 규제 기능을 가지고 있습니다. 이 기능은 절연 핵에 유동 세포 계측법에 의해 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수 있습니다 여기에 제시된 방법으로 공부 할 수 있습니다

초록

호중구는 말초 혈에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 이러한 세포 따라서 미생물을 침해에 대한 방어의 첫 번째 줄되고, 염증 및 감염의 사이트에 게재 처음입니다. 호중구는 phagocytosis, lytic 효소의 출시, 그리고 반응성 산소 종의 생산과 같은 중요한 항균 기능을 가지고 있습니다. 다음과 같은 중요한 방어 기능뿐만 아니라, 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등의 감염에 대한 응답으로 다른 작업을 수행 할 수 있습니다. 크린 시토 킨은 감염을 선명하게 할 수 다른 백혈구를 모집하고, apoptosis의 억제는 호중구는 감염의 사이트에 더 오래 살 수 있습니다. 이 함수는 스크립트 수준의 규제를받습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 더 effi가 없기 때문에 그러나, 이러한 세포의 transcriptionally 규제 응답의 연구는 종래의 리포터 유전자 방법으로 수행 할 수 없습니다호중구 transfection에 대한 cient 기술. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 순수 호중구를 분리하는 기술을 설명, 안티 - 수용체 항체와 함께이 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석 할 수 있습니다. 방법이 성공적으로 호중구 및 다른 세포 유형에서 핵으로 NF-κB와 엘크-1 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 따라서,이 방법은 세포 유형의 다양한 절연 핵에서 전사 인자의 활성을 분석하기위한 옵션을 나타냅니다.

서문

호중구는 말초 혈 ^1의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 염증과 감염 호중구 동안 그들은 방어 ^2의 첫 번째 줄의 역할을 어디에 해당 사이트에 표시 할 수있는 최초의 세포입니다. 호중구는 phagocytosis, 반응성 산소 종의 생산, degranulation의 lytic 효소의 출시, 그리고 ^4,5 염증성 크린 시토 킨의 생산 등 여러 가지 항균 메커니즘 ³ 가지고 있습니다. 호중구는 빠른 속도로 다양한 세포 표면 수용체에서 신호를 통해 작동하게 수명이 짧은 세포입니다. 호중구는 자신의 짧은 수명으로 인해 터미널 셀을 고려하여 염증 과정을 ^여섯 동안 활성화하지 않는 한 그들은 apoptosis를 받아야하기 때문에, 그것은 그들은 또한 특정 유전자의 전사 수준을 변경하여 자신의 표현형을 수정할 수 있도록 지금 명확되어 있지만. 크린 시토 킨 ⁵ apoptosis ^7,8의 억제의 생산은 두있다,mportant 활성화에 의존적 세포 기능은 호중구의 전사 수준에서 조절. 원자력 요소 κB (NF-κB)는 시토 킨 생산 ^(4)의 전사 조절과 세포 생존과 다양한 세포 유형에 apoptosis ^9-11의 규정에 참여하고 있습니다.

핵 인자 활성화로 이어질 신호 경로는 일반적으로 기자 유전자 assays 또는 전기 영동 이동의 assays (EMSA)에 의한 연구하고 있습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 호중구 transfection에 대한 효율적인 기술이 없으므로 다만,이 셀에 transcriptionally 규제 응답의 연구는, 기자 유전자 assays을 수행 할 수 없습니다. EMSA의 assays는 핵 인자 활성화 ^12,13을 둘러 호중구에 사용 된, 그 방사성 물질의 사용을 포함하기 때문에 그러나,이 방법은 복잡하고 비용이 있습니다. Nucleofection는 successfu 사용되었습니다 또 다른 방법입니다베드로 단핵 세포 ¹⁴ transfect합니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 핵 인자 정품 인증 (낮은 효율에도 불구하고) transfection에 의해 호중구에서 감지 될 수 있습니다. 그러나,이 기술은 더 비싼 시간이 오래 걸릴뿐 아니라 아마도 덜 정량 것이다. immunostained 세포의 현미경 분석도 핵에 핵 요소를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 핵이 방법 ^15로 NF-κB의 translocation를 발견했습니다. 불행하게도,이 기술은 또한 시간이 많이 걸리는 덜 양적, 그리고 관찰자의 편견에 따라 달라질 수 있습니다.

여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 기술을 설명, (F, 안티 - 수용체 항체와 integrins 또는 FC 수용체를 통해 이러한 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석igure 1). 방법이 성공적으로 NF-κB ¹⁵ 호중구 핵의 엘크-1 ¹⁶ 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 이 방법의 감도는 핵의 핵 요소 수준의 작은 변화를 감지 할 수 있습니다. 이 방법은 다른 세포 유형에서 핵에서 전사 인자의 수준을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 인간의 피에서 호중구의 절연 (PMN)

1. 항응고제로 헤파린 (10 U / ML)로 약 20 ML 인간의 피를 사용하십시오. 피 venopuncture으로 성인 건강 자원 봉사자로부터 수집되었다. UNAM - 모든 실험은 Instituto 드 Investigaciones Biomédicas의 생명 윤리위원회의 승인하에 수행되었다.
2. 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 PBS에서 6% dextran T500의 2 ML을 넣고 혈액의 10 ML를 추가합니다. 반전 지하철로 두 세 번 혼합하고 적혈구 침강을 할 수 있도록 45 분에 앉아 보자.
3. 신선한 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브의 5 ML Ficoll-Paque두고.
4. sedimented 적혈구 위에 형성 백혈구 풍부한 플라즈마을 가지고, 신중하게 두 번째 층을 형성 Ficoll-Paque 상단에 피펫. 두 단계가 있는지 확인합니다.
5. 4 ° C.에 20 분에 516 XG에 원심 분리기 원심 분리 한 후, 플라즈마 및 Ficoll-Paque의 계면에서 mononuclear 세포의 층이 있습니다. NEutrophils는 튜브의 하단에 있습니다.
6. 표면에 뜨는을 제거, 선반 위에 튜브를 활용하여 세포 펠렛을 아프게하고, 감기의 10 ML (4 ° C) PBS 참고 추가하여 세포를 resuspend :. 최대 pipetting하여 세포를 Resuspending이 너무이기 때문에 다운이 권장하지 않습니다를 세포에 손상.
7. 4 ° C.에서 5 분 동안 290 XG에서 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송
8. 이전처럼 세포 펠렛을 부숴 10 감기 ML (4 ° C) 적혈구를 lyse 할 수 hypotonic 솔루션 (0.2 % NaCl, 1 % BSA, 20 MM Hepes, 산도 = 7.4).을 추가 정확히 1 분 손으로 부드럽게 관을 회전하여 섞는다.
9. 10 감기 ML (4 ° C) hypertonic 솔루션 (1.6 % NaCl, 1 % BSA, 20 MM HEPES, pH를 = 7.4), 믹스와 hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다 (일반적으로> 95 %는 PMN합니다.)을 추가
   참고 : 셀을 계산하는 동안 얼음에 세포 현탁액으로 관을하세요.
10. 이전처럼 원심 분리기와 10 PMN을 resuspend추위 7 셀 / ML (4 ° C) PBS. 얼음 계속.
    참고 : 호중구는 4에서 가능한 및 기능 유지 8-6에 대한 시간에 대한 ° C.

2. PMN 활성화

1. 100 PMN의 정지 μl (1 × 10 ⁷ 셀 / ML) 1.5 ML Eppendorf 튜브에. 놔
   참고 : 샘플 튜브가 최소 중복으로 수행해야합니다. 대개 부정적인 컨트롤은 만 사용 항체, 및 보조 항체를 포함해야합니다.
2. 10 μg / ML에서 해당 항 인테그린 또는 안티 FC 수용체 단클론 항체 (적인 mAb)를 추가하고 15 분에 얼음에 품다.
3. 한 감기 ML (4 ° C) PBS, microcentrifuge에서 1,743 XG (4,500 RPM)에서 centrifuging하고 표면에 뜨는을 aspirating.을 추가하여 PMN을 씻으십시오
4. 랙에 대한 관의 하단을 클릭하여 세포 펠렛을 부숴, 1 ML 차가운 PBS를 추가하고 두 번 이전 단계에서와 같이을 씻는다.
   참고 :이 언 바운드 항체를 제거 씻는다.
5. 동일한에 Resuspend의 PMN (에따뜻한의 itial) 볼륨 (37 ° C) PBS는 F의 60 μg / ML (AB ') 2 염소 안티 - 마우스 IgG를 포함하는.
   참고 : 보조 안티 마우스 IgG 항체가 첫 번째 반 수용체 항체에 바인딩되며, 수용체의 crosslinking가 발생합니다.
6. 관심 핵 요인에 따라 1-20 분에 대해 37 ° C에서 알을 품다. NF-κB 보통 15 분을 위해, 그리고 보통 엘크-1 5 분에.
   참고 : 37에서 셀을 잠복기가 4시에 개최 할 수 없습니다 ° C 유도 수용체 crosslinking, ° C.
7. 한 ML 차가운 PBS를 추가하고 microcentrifuge에서 1,743 XG에서 3 분 원심 분리기.
8. 표면에 뜨는 제거
9. dry-ice/ethanol 욕조에서 즉시 PMN 10 분 동안 거기를 유지 멈춰 봐.

3. 핵의 절연 및 고정

1. 100 μl 추위에 Resuspend 냉동 PMN 펠릿 (4 ° C) hypotonic 버퍼 (10 MM의 HEPES, 10 MM KCl, 1.5 MM MgCl _2, 1 ㎜ 갓 부가 _{DL-dithiothreitol} [DTT], 산도 = 7.9). 그것은 하나 dry-ice/ethanol 욕조 하나의 튜브를 꺼내하고, hypotonic 버퍼를 추가하기 전에 관의 바닥을 청소 닦아 것이 좋습니다.
2. 얼음에 장소, 그리고 trypan 파랑과 핵 정지의 나누어지는 얼룩에 의해 핵의 무결성을 확인합니다. 핵은 원형과 파란색 봐. 그대로 PMN는 물들, 그리고 세포 파편이 불규칙 모양의 푸른 색 입자로 표시되지 않습니다.
   참고 : 핵 서스펜션은 많은 손상 셀이나 먼지가 포함 된 경우는 준비를 버리고 다른 샘플과 절차를 반복하는 것이 좋습니다.
3. 감기 객실 내 10 분에 microcentrifuge에 775 XG (3,000 RPM)에서 핵을 원심 분리기. 이 포인트 핵에서 매우 약한 및 엑스트라 케어 샘플은 추위와 과도한 힘에 centrifuging하지 유지에서 촬영해야합니다.
4. 아주 조심 pipetting하여 표면에 뜨는을 제거합니다.
5. 핵 문제를 해결하기 위해 PBS에 찬 4 % paraformaldehyde 100 μl를 추가합니다.
   참고 : 펠렛은 매우을 상실합니다D 버퍼를 추가하면 핵을 resuspend에 충분하다. 아래로 Pipetting하며 피해야한다.
6. 20 분에 얼음에 품다.
7. Immunolabel의 유동 세포 계측법을위한 핵 또는 4에서 최대 24 시간까지 위해를 유지 ° C.

4. 유동 세포 계측법 분석을위한 핵의 Immunolabeling

1. 1 분에 microcentrifuge에서 1,743 XG (4,500 RPM)에서 핵을 원심 분리기, 매우 부드러운 pipetting하여 표면에 뜨는 제거합니다.
2. 100 감기 μl (4 ° C) 0.1 % 트리톤 X-100, 핵을 permeabilize하기 위해 PBS에 4 % paraformaldehyde.을 추가 10 분 동안 얼음에 품다.
3. 원심 분리기는 microcentrifuge에서 1,743 XG에서 핵을 permeabilized 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 이 시점에서 핵 알약은 튜브의 하단에 잘 부착하지 않습니다. 이 펠릿을 떨어 도착하면 다시 원심 분리기하는 것이 좋습니다.
4. 특이 현상 바인딩 사이트를 차단하고 20 분에 얼음을 품다하기 위해 PBS에 찬 4% 태아 소 혈청 (FBS) 500 μl에 Resuspend 핵. 원심 분리기1743의 핵은 microcentrifuge에서 3 분 동안 XG 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다.
5. 4퍼센트 FBS와 2.5 μg / 관심의 핵 요소에 대한적인 mAb의 ML을 포함하는 차가운 PBS 100 μl에 핵을 Resuspend. 20 분에 얼음에 품다.
   참고 : 대개 부정적인 컨트롤은 안티 핵 인자 항체를 포함 FITC-라벨 차 항체 만합니다.
6. 4퍼센트 FBS와 3 분에 1,743 XG에서 centrifuging과 차가운 PBS 500 μl를 두 번 씻으십시오.
7. 4퍼센트 FBS 및 10 μg / 해당 FITC-라벨 차 항체의 ML을 포함하는 차가운 PBS 100 μl에, 아주 조심 resuspend 핵을 표면에 뜨는을 제거하고, 20 분에 얼음에 품다.
8. 이전 단계에서와 같이 4퍼센트 FBS와 차가운 PBS 500 μl를 두 번 핵을 씻으십시오.
9. PBS의 추운 4 % paraformaldehyde 400 μl에 핵을 Resuspend.
   참고 : 핵은 샘플이 오염없이 며칠 동안 저장 될 수 있도록 paraformaldehyde에 배치됩니다혈청의 면전에서 발생할 수있는 문제.
10. 최대 3 일에 4에 유동 세포 계측법이나 어둠 속에서 매장 ° C에서 즉시 분석 할 수 있습니다.

5. 유동 세포 계측법 분석

1. 또는 이와 유사한 장치, 흐름 cytometer 같은 FACScan (프랭클린 호수, NJ Becton 디킨슨)에 immunolabeled 핵을 분석합니다.
2. 196에서 로그 스케일에서 SSC, 그리고 점 플롯의 게이트 핵, 10-1에서 로그 스케일로 FSC :에 수집 설정을 조정합니다.
3. 샘플 당 만 핵을 습득.
4. 400 로그 스케일로 설정 FL-1 채널 (506 nm 정도)를 통해 FITC-스테인드 핵의 형광을 분석합니다.

결과

정화 방법은 여기에 설명하는 것이 95 % (그림 1A)보다 큰 결함으로 unstimulated 호중구 (PMN)를 제공합니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 우리는 FC 수용체와 integrins (그림 1B)를 통해 PMN을 자극했다. 일단 자극, PMN은 lysed하고 핵은 높은 수율로 분리되어 있습니다. 핵은 그러한 특정 항체와 핵 요소 κB (NF-κB),

토론

여기에 설명 된 정화 방법은 짧은 시간에 95 % (현미경 관찰에 의해 평가)보다 큰 결함이있는 unstimulated 호중구의 분리 (PMN)를 할 수 있습니다. 후자가 완전히 lysed되지 않은 경우 때때로 호중구는 적혈구에 의해 오염 될 수 있습니다. 적혈구와 PMN 쉽게 유동 세포 계측법에 의해 서로 다른 세포 집단으로 구별 할 수 있기 때문에 이것은 보통, 기술에 영향을주지 않습니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur