Eine einfache und effiziente Methode, um Nuclear Factor Aktivierung in menschlichen Neutrophilen Erkennen von Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im Blut. Neutrophile besitzen transkriptionell reguliert Funktionen wie Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Diese Funktionen können mit dem hier vorgestellten Verfahren, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren können mittels Durchflusszytometrie in isolierten Zellkernen untersucht werden

Zusammenfassung

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut. Diese Zellen sind die ersten, an den Standorten der Entzündung und Infektion auftreten und somit als erste Verteidigungslinie gegen eindringende Mikroorganismen. Neutrophile besitzen wichtige Funktionen wie antimikrobielle Phagozytose, Freisetzung von lytische Enzyme, und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. Zusätzlich zu diesen wichtigen Abwehrmechanismus funktioniert, führen Neutrophilen andere Aufgaben in Reaktion auf eine Infektion wie die Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und Hemmung der Apoptose. Zytokine rekrutieren andere Leukozyten, die klar die Infektion zu helfen, und die Hemmung der Apoptose ermöglicht die Neutrophilen, länger zu leben am Ort der Infektion. Diese Funktionen werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit herkömmlichen Reportergen Verfahren durchgeführt werden, da es keine effiziente sindziente Techniken für neutrophilen Transfektion. Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Methoden zur reinen Neutrophilen aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie. Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB und Elk-1 Kernfaktoren in Kernen von Neutrophilen und anderen Zelltypen erkennen. Somit stellt diese Methode eine Option zum Analysieren Aktivierung von Transkriptionsfaktoren an isolierten Kernen aus einer Vielzahl von Zelltypen.

Einleitung

Neutrophile sind die häufigsten Leukozyten im peripheren Blut ^ein. Während Entzündungen und Infektionen Neutrophile sind die ersten Zellen, die an der betroffenen Stelle erscheinen, wo sie als erste Verteidigungslinie ² handeln. Neutrophile besitzen mehrere antimikrobielle Mechanismen ³ einschließlich Phagozytose, die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Freisetzung von lytischen Enzymen durch Degranulation und Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen ^4,5. Neutrophile sind kurzlebige Zellen, die sich schnell durch Signalisierung von verschiedenen Rezeptoren auf der Zelloberfläche werden aktiviert. Obwohl Neutrophilen wurden berücksichtigt terminalen Zellen aufgrund ihrer kurzen Lebensdauer und weil sie Apoptose, wenn während des entzündlichen Prozesses ⁶ aktiviert unterziehen, ist es nun klar, dass sie auch ändern ihren Phänotyp, indem Sie die Ebene der Transkription bestimmter Gene. Die Produktion von Cytokinen ⁵ und der Hemmung der Apoptose ^7,8 sind zwei iW ichtig aktivierungsabhängige Zellfunktionen auf der Ebene der Transkription in Neutrophilen reguliert. Nuclear factor kappaB (NF-kB) beteiligt sich an der transkriptionalen Kontrolle Zytokinproduktion ⁴ und bei der Regulation der Apoptose und Überleben der Zellen ^9-11 in verschiedenen Zelltypen.

Die Signalwege, die nuclear factor-Aktivierung führen, sind in der Regel durch Reportergen-Assays oder durch elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (EMSA) untersucht. Da jedoch Neutrophilen kurzlebigen Zellen sind, kann die Untersuchung von transkriptionell reguliert Reaktionen in diesen Zellen nicht mit Reportergen-Assays durchgeführt werden, da es keine effiziente Methoden zur Transfektion sind Neutrophilen. EMSA-Assays wurden in Neutrophilen verwendet worden, um nuclear factor-Aktivierung ^12,13 erkunden, allerdings ist diese Methode aufwendig und teuer, da es die Verwendung von radioaktivem Material beinhaltet. Nukleofektion ist eine weitere Technik, die verwendet wurde successfully zu transfizieren Monozyten ^14. Somit zumindest theoretisch könnte Kernfaktor Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch Transfektion detektiert werden (trotz niedriger Effizienz). Jedoch würde diese Technik teurer sein, zeitaufwendig und wahrscheinlich weniger quantitativ. Mikroskopische Analyse immunogefärbten Zellen könnten auch verwendet werden, um atomaren Faktoren im Kern zu erfassen. Tatsächlich haben wir NF-KB-Translokation in den Zellkern ¹⁵ auf diese Weise detektiert. Leider ist diese Technik auch zeitaufwendig, weniger quantitative und vorbehaltlich des Betrachters Bias.

Hier stellen wir eine einfache und effiziente Methode, die Detektion und Quantifizierung von nuklearen Faktoren isoliert und immunmarkierten Kerne mittels Durchflusszytometrie erlaubt. Wir beschreiben Techniken an Neutrophile aus humanen peripheren Blut zu isolieren, diese Zellen zu stimulieren über Integrine oder Fc-Rezeptoren mit anti-Rezeptor-Antikörpern, zu isolieren und immunolabel Kerne und analysieren Kerne durch Durchflusszytometrie (FBBILDUNG 1). Die Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um NF-kappaB ¹⁵ und Elk-1 ¹⁶ Kernfaktoren in neutrophilen Kerne zu erkennen. Die Empfindlichkeit dieses Verfahren ermöglicht den Nachweis von kleinen Änderungen in nuclear factor Ebenen im Zellkern. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um das Niveau von Transkriptionsfaktoren in Kernen von anderen Zellarten zu analysieren.

Protokoll

Ein. Isolation von Neutrophilen (PMN) aus menschlichem Blut

1. Verwenden etwa 20 ml Humanblut mit Heparin (10 U / ml) als Antikoagulans. Blut wurde von gesunden erwachsenen Freiwilligen durch intravenösen gesammelt. UNAM - Alle Experimente wurden unter Zustimmung des Bioethik-Ausschusses am Instituto de Investigaciones Biomédicas getan.
2. Geben Sie 2 ml 6% Dextran T500 in PBS in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und 10 ml Blut. Mix durch Invertieren des Röhrchens zwei oder drei Mal und lassen Sie es für 45 Minuten sitzen, um für Blutsenkungsgeschwindigkeit ermöglichen.
3. In einem frischen 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen legte 5 ml Ficoll-Paque.
4. Nehmen Sie die Leukozyten-reiche Plasma, das über sedimentiert Erythrozyten gebildet und sorgfältige Pipettierung es oben auf der Ficoll-Paque Bildung einer zweiten Schicht. Stellen Sie sicher, gibt es zwei Phasen.
5. Zentrifuge bei 516 × g für 20 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation an der Interphase von Plasma und Ficoll-Paque befindet sich eine Schicht von mononukleären Zellen. Neutrophils sind am Boden des Röhrchens.
6. Beseitigen Sie den Überstand, brechen das Zellpellet indem das Rohr gegen ein Rack und die Zellen resuspendieren durch Zugabe von 10 ml kaltem (4 ° C) PBS. Hinweis: Resuspendieren der Zellen durch Auf-und Abpipettieren wird nicht empfohlen, da dies zu schädlich für die Zellen.
7. Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 290 × g für 5 min bei 4 ° C.
8. Brechen Sie das Zellpellet nach wie vor und mit 10 ml kaltem (4 ° C) hypotone Lösung (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4), um Erythrozyten zu lysieren. Mix durch Verwirbelung das Rohr vorsichtig von Hand genau eine Minute.
9. 10 ml kaltem (4 ° C) hypertonischen Lösung (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mischen und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometer (in der Regel> 95% PMN).
   Hinweis: Bewahren Sie den Schlauch mit der Zellsuspension auf Eis beim Zählen der Zellen.
10. Zentrifuge nach vor und resuspendieren PMN bei 107 Zellen / ml in kaltem (4 ° C) PBS. Halten Sie auf dem Eis.
    Hinweis: Neutrophile lebensfähig bleiben und funktionelle bei 4 ° C für etwa 6 bis 8 Stunden.

2. Aktivieren PMN

1. Legen Sie 100 ul PMN Suspension (1 x 10 ⁷ Zellen / ml) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
   Hinweis: Probengefäss sollte mindestens in Doppelbestimmung durchgeführt werden. Übliche negative Kontrollen sollten erste Antikörper nur, und sekundären Antikörper nur die.
2. Fügen Sie die entsprechenden Anti-Integrin oder anti-Fc-Rezeptor monoklonaler Antikörper (mAb) mit 10 ug / ml und Inkubation auf Eis für 15 min.
3. Waschen PMN durch Zugabe von 1 ml kaltem (4 ° C) PBS, Zentrifugation bei 1.743 xg (4.500 rpm) in einer Mikrozentrifuge und Absaugen des Überstandes.
4. Brechen Sie das Zellpellet durch Antippen der Unterseite des Rohrs gegen ein Rack, 1 ml kaltem PBS, und waschen Sie noch zwei weitere Male, wie im vorherigen Schritt.
   Hinweis: Diese wäscht Entfernung ungebundener Antikörper.
5. Resuspendieren PMN in der gleichen (initial) Volumen von warmem (37 ° C) PBS, enthaltend 60 ug / ml F (ab ') 2 Ziegen anti-Maus-IgG.
   Anmerkung: Die sekundären anti-Maus-IgG-Antikörper wird an den ersten anti-Rezeptor-Antikörper zu binden und Vernetzung des Rezeptors verursachen.
6. Bei 37 ° C während 1 bis 20 min, je nach Kernfaktor von Interesse. Für NF-KB üblicherweise 15 min und für Elk-1 üblicherweise 5 min.
   Hinweis: Die Inkubation der Zellen bei 37 ° C induziert Rezeptor-Vernetzung, die nicht stattfinden kann bei 4 ° C.
7. 1 ml kaltem PBS und zentrifugieren 3 min bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge.
8. Überstand entfernen
9. Frieren PMN sofort dry-ice/ethanol Bad und halten sie dort für 10 min.

3. Isolation und Fixierung der Kerne

1. Resuspendieren gefrorenen PMN Pellet in 100 ul kaltem (4 ° C) hypotonischen Puffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl _2, und 1 mM frisch-added _{DL-Dithiothreitol} [DTT], PH = 7,9). Es wird empfohlen, die Rohre nehmen aus dem dry-ice/ethanol Bad eins nach dem anderen, und Wischen Sie die Unterseite des Rohres vor der Zugabe der hypotonen Puffer.
2. Auf Eis, und überprüfen Kerne Integrität durch Färbung einen aliquoten Teil der Kerne Suspension mit Trypanblau. Kerne umsehen und blau. PMN intakten nicht angefärbt, erhalten und Zelltrümmer erscheint als blaue Teilchen von unregelmäßiger Form.
   Hinweis: Wenn Kerne Suspension enthält viele intakte Zellen oder Schmutz, ist es besser, die Vorbereitung zu verwerfen und wiederholen Sie den Vorgang mit einer anderen Probe.
3. Zentrifuge Kerne bei 775 xg (3.000 rpm) in Mikrozentrifuge für 10 min in einem kalten Raum. An diesem Punkt Kerne sehr zerbrechlich und besondere Sorgfalt sollte im Einklang die Proben kalt und nicht Zentrifugieren bei übermäßigen Kräften getroffen werden.
4. Überstand entfernen, indem Sie sehr vorsichtig Pipettieren.
5. Je 100 ul kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne zu fixieren.
   Hinweis: Das Pellet wird sehr locker eind Zugabe des Puffers ausreicht, um die Kerne zu resuspendieren. Und Abpipettieren sollte vermieden werden.
6. Inkubieren auf Eis für 20 min.
7. Immunolabel Kerne für die Durchflusszytometrie oder halten sie für bis zu 24 Stunden bei 4 ° C.

4. Kerne Immunmarkierung für die Durchflusszytometrie-Analyse

1. Zentrifuge Kerne bei 1.743 xg (4.500 rpm) in Mikrozentrifuge für 1 min, und entfernen Sie Überstand durch sehr vorsichtiges Pipettieren.
2. Je 100 ul kaltem (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% Paraformaldehyd in PBS auf Kerne permeabilisieren. Inkubieren auf Eis für 10 min.
3. Centrifuge permeabilisiert Kerne bei 1.743 xg in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. An diesem Punkt Kerne Pellets nicht gut befestigen am Boden des Röhrchens. Es wird empfohlen, wieder zentrifugiert, wenn das Pellet wird locker.
4. Resuspendieren Kerne in 500 ul kaltem 4% fötales Rinderserum (FBS) in PBS unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, und Inkubieren auf Eis für 20 min. ZentrifugierenKerne bei 1.743 xg für 3 min in Mikrozentrifuge und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
5. Resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 2,5 ug / ml des mAb gegen den nuclear factor von Interesse. Inkubieren auf Eis für 20 min.
   Hinweis: Übliche negative Kontrollen sollten Anti-Atomkraft-Antikörper nur beinhalten, und FITC-markierten sekundären Antikörper nur.
6. Zweimal waschen mit 500 ul kaltem PBS mit 4% FBS und Zentrifugation bei 1743 xg für 3 min.
7. Entfernen Sie den Überstand sehr vorsichtig resuspendieren Kerne in 100 ul kaltem PBS mit 4% FBS und 10 ug / ml des entsprechenden FITC-markierten sekundären Antikörper und Inkubation auf Eis für 20 min.
8. Waschen Kerne zweimal mit 500 &mgr; l kaltem PBS mit 4% FBS wie in den vorangegangenen Schritt.
9. Resuspendieren Kerne in 400 &mgr; l kaltem 4% Paraformaldehyd in PBS.
   Anmerkung: Die Zellkerne werden in Paraformaldehyd platziert, damit die Probe für mehrere Tage gelagert werden ohne KontaminationProbleme, die in der Gegenwart von Serum auftreten kann.
10. Analysieren sofort durch Durchflusszytometrie oder dunkel lagern bei 4 ° C bis zu drei Tage.

5. Durchflusszytometrie-Analyse

1. Analysieren immunmarkierten Kerne in einem Durchflußzytometer wie einem FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) oder einer ähnlichen Vorrichtung.
2. Passen Akquisition Einstellungen: FSC bei log-Skala auf 10-1, SSC bei log-Skala bei 196 und Gate-Kerne in einem Dot-Plot.
3. Erwerben zehntausend Kerne pro Probe.
4. Analysieren Fluoreszenz von FITC-gefärbten Zellkernen durch die FL-1-Kanal (506 nm) bei log-Skala auf 400 eingestellt.

Ergebnisse

Die Reinigung hier beschriebene Methode der Regel bietet unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit von mehr als 95% (Abbildung 1A). Isoliert PMN kann dann durch Vernetzung insbesondere Rezeptoren mit spezifischen monoklonalen Antikörpern stimuliert werden. Wir haben PMN durch Fc-Rezeptoren und Integrine (1B) stimuliert. Einmal stimuliert, PMN lysiert und Kerne mit hohen Ausbeuten isoliert. Kerne werden dann für eine bestimmte nuclear factor, wie die Kernfaktor kappaB (NF-kB...

Diskussion

Die Reinigung hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von unstimulierten Neutrophilen (PMN) mit einer Reinheit größer als 95% (bestimmt durch mikroskopische Beobachtung), in einer kurzen Zeit. Manchmal kann durch Neutrophile Erythrozyten kontaminiert werden, wenn letztere nicht vollständig lysiert werden. Dies bedeutet in der Regel nicht auf die Technik, da Erythrozyten und PMN kann leicht als deutliche Zellpopulationen mittels Durchflusszytometrie unterschieden werden. Isoliert PMN kann dann durch Verne...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
			EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur