تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام bromodeoxyuridine (BrdU) امتصاص للسماح تتبع الزمني للخلايا التي كانت في المرحلة S في نقطة محددة في الوقت المناسب. إضافة الأصباغ الحمض النووي ووضع العلامات الأجسام المضادة تسهل تحليل مفصل لمصير الخلايا مرحلة S في أوقات لاحقة.

Abstract

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

Introduction

تقييم ميزات دورة الخلية والتغيرات التي تحدث في الخلايا أثناء تقدم دورة الخلية هو أمر أساسي لفهم جوانب كثيرة من الأحياء، لا سيما بيولوجيا السرطان. العديد من وكلاء في التنمية لعلاج الأورام الخبيثة يكون لها آثار عميقة على تقدم دورة الخلية أو لحث على موت الخلايا عبر دورة الخلية الآليات التي تعتمد على. من أجل دراسة ديناميات دورة الخلية أو الخلايا في مرحلة معينة من مراحل دورة الخلية، ومن المعتاد لمزامنة الخلايا. ومع ذلك أساليب التزامن يمكن أن يكون لها آثار ضارة على خلايا التي تجري دراستها، يحتمل أن يفند النتائج التي تم الحصول عليها. ¹ تحليل الآونة الأخيرة استخدام البروتينات الموسومة fluorescently التي تكون موجودة إلا في مراحل معينة من دورة الخلايا ويسمح للتقدم دورة الخلية في الخلايا واحد على مر الزمن ^2، إلا أن الخلايا لدراستها الحاجة إلى معالجته وراثيا للتعبير عن هذه البروتينات الموسومة مما يحد من وإلى أنظمة حيث هذا يمكن قراءةحققت إيلي.

تتكون دورة الخلية من مرحلتين النشطة: مرحلة التوليف (S)، حيث يتم نسخ DNA والانقسام (M) حيث انقسام الخلية تأخذ مكان. يتم فصل هذه المراحل من خلال ثلاث مراحل الفجوة، G _0، G ₁ و ₂ G. G ₀ أو السكون، هو مرحلة الراحة حيث ترك الخلية دورة، G ₁ حيث تزيد من الخلايا في الحجم قبل تكرار الحمض النووي وG ₂ حيث يستمر نمو الخلايا بين الانتهاء من تكرار الحمض النووي ولكن قبل انقسام الخلية. يتم التحكم في تطور من خلال دورة الخلية من قبل عدد من نقاط التفتيش. تنشيط G ₁ نقطة تفتيش عندما تكون الظروف البيئية ليست داعمة لتخليق DNA ويمنع دخول مرحلة S. ويمكن أن تظهر نقطة تفتيش المرحلة داخل S أو تأخير من قبل الحمض النووي من التلف الذي قد يؤدي إلى تكرار الشوك المتوقفة. خلال G ₂ تأكيد الإخلاص من الحمض النووي تتكرر وإذا تم الكشف عن الأضرار ثم G ₂ نقطة تفتيش سمحت إصلاح الحمض النووي قبل انقسام الخلايا. A نقطة تفتيش النهائي خلال الانقسام يضمن أن الصبغيات تم محاذاة بشكل صحيح في لوحة الإنقسامية حتى يمكن الانتهاء من هذا الانقسام الخلوي بنجاح. يستخدم ³ تفعيل هذه الحواجز عادة لمزامنة السكان الخلية. نقاط التفتيش دورة الخلية يمكن تفعيلها من خلال عدد من العوامل ولكن في بيولوجيا السرطان الأكثر شيوعا هو الكشف عن الحمض النووي من التلف. تبدأ الاستجابة الحمض النووي من التلف من قبل مثل PI3 كيناز توسع الشعريات تحركات ترنح وRad3 ذات الصلة (ATR) وترنح توسع الشعيرات تحور (ATM) التي تنشط تحركات المستجيب المصب Chk1 وChk2، على التوالي. ³ وهناك مجموعة من الأحداث ينشط Chk1 بما المتوقفة تكرار الشوك، crosslinks DNA، وأضرار الأشعة فوق البنفسجية في حين يتم تنشيط Chk2 المقام الأول عن طريق الكسر مزدوج الحبل.

الطريقة المعتادة لدراسة تأثير الظروف المتغيرة على طول ط دورة الخليةالصورة لمزامنة الخلايا في مرحلة معينة من مراحل دورة الخلية. ¹ وهذا لا يمكن أن يتحقق من خلال عدة طرق. الخلايا يمكن جسديا منعزلة على أساس الحجم والكثافة، مبعثر الجانب (التفاصيل)، وعلامات التعبير سطح الخلية. أكثر عمليا، قد تكون متزامنة الخلايا عن طريق الوسائل الكيميائية. عدة عوامل مثل الثيميدين، هيدروكسي يوريا والسيتوزين الأرابينوزيد يمكن أن تستخدم لتثبيط تخليق DNA في المرحلة S من دورة الخلية مما يؤدي إلى تراكم الخلايا في مرحلة S التي لا تزال ركوب الدراجات بعد إزالة العوامل. خلايا تعامل مع نوكودازول، الذي يمنع تشكيل المغزل الإنقسامية والاعتقال مع G ₂ - أو M-مرحلة محتوى الحمض النووي. القضاء على المصل من نتائج مستنبت في تراكم الخلايا في G ₀ المرحلة. إعادة بالإضافة للمغذيات داخل المصل ثقافة إعادة يبدأ ركوب الدراجات العادية للخلايا. ومع ذلك، كل من هذه الأساليب تزامن تتداخل مع ركوب الدراجات العادية ونمو الخلايا ويمكن بالنتيجهتي في موت الخلايا كبيرة.

تزامن خلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد هو تحديا من نوع خاص، وهذه الخلايا ليست قابلة للتلاعب الجيني. الطريقة الموصوفة هنا يسمح تقييم ديناميكيات دورة الخلية ودراسة الخلايا في مراحل معينة من دورة الخلية دون تزامن التقليدي أو التعديل الوراثي. هذه الطريقة قد تكون مفيدة لأنواع الخلايا الأخرى التي لم تتحقق التعديل الوراثي وتزامن الإجراءات التقليدية بسهولة أيضا. وتستند هذه الطريقة على استخدام عريقة من bromodeoxyuridine (BrdU) التأسيس، والذي له تأثير ضئيل جدا على النمو على المدى القصير وتكاثر الخلايا. ⁴ بروتوكولات BrdU تأسست الاستفادة من إدماج BrdU الى الحمض النووي مركبة جديدة خلال المرحلة S . هذا يمثل بشكل دائم الخلايا بأنها كانت في المرحلة S أثناء التعرض BrdU. يمكن التعرف على هذه الفئة من السكان في نقطة زمنية لاحقة من قبل تلطيخ لBrdU incorporأوجه، وبالتالي يكون بمثابة السكان متزامنة التي يمكن اتباعها وتقييمها على مر الزمن السماح دراسة آثار المخدرات على دورة الخلية العبور. يحتاج BrdU أن تتعرض قبل تلوين الأجسام المضادة، التي تحققت عادة بعد الدناز أو العلاج حامض. ^6،7 عن طريق التدفق الخلوي للكشف BrdU أدرجت يمكن إدراج علامات إضافية. والأهم هو استخدام الأصباغ لقياس محتوى الحمض النووي، مما يتيح تقييم دورة الخلية توزيع المرحلة من الخلايا التي كانت في المرحلة S في بداية الدراسة. ويمكن أيضا ⁸ السطح أو داخل الخلايا المستضدات وعلاوة على ذلك إضافية دراستها. ⁹ هذه قد تتعلق بأحداث دورة الخلية مثل Ki67 أو ميزات الخلية لتبدو غير ذات صلة مثل علامات موت الخلايا المبرمج مثل المشقوق كاسباس 3. التطبيقات المحتملة محدودة من الخيال المحقق.

Protocol

بروتوكول الموصوفة هنا يستخدم الليمفاوي خط خلية سرطان الدم الحاد NALM6 لكن يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى.

1. حلول والكواشف

1. كامل RPMI
   1. إضافة 56 مل مصل العجل الجنين (FCS) و 5.5 مل من 200 ملي L-الجلوتامين لزجاجة 500 مل من المتوسط ​​RPMI-1640.
2. BrdU محلول المخزون
   1. إعداد 32.5 ملي BrdU (10 ملغ / مل) في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS).
3. BrdU كاملة RPMI
   1. إضافة 6.2 ميكرولتر من BrdU حل سهم إلى 10 مل من RPMI كاملة.
4. الدناز الحل
   1. إعداد 1 ملغ الدناز / مل في DPBS.
5. تلطيخ العازلة
   1. إعداد 3٪ الحرارة المعطل FCS و0.09٪ أزيد الصوديوم في DPBS.
6. الرجوع إلى قائمة المواد اللازمة للتعريفات التثبيت العازلة، Permeabilization العازلة وغسل العازلة.

2. خلايا

لاوكانت الزنازين لا تربيتها لمدة تزيد عن 6 أشهر: الشركة المصرية للاتصالات. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف مباشرة إلى أي خط الخلايا غير ملتصقة مع تعديلات لكثافة الخلايا وسائل الإعلام والثقافة. استخدام الخلايا التي تنمو باطراد في بدء التجربة.

1. الحفاظ على خلايا NALM6 في قوارير ثقافة T-75 في استكمال RPMI. تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة باستخدام الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
   1. الحفاظ على خلايا NALM6 بين 1-2 × 10 ⁶ خلايا لكل مل عن طريق تقسيم ثقافة ثلاث مرات أسبوعيا.
   2. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ في الهواء.

3. نبض صفها من الخلايا مع BrdU

تنبيه: التعامل مع BrdU مع الرعاية كما هو المغير المحتملين ومشوه.

1. خلايا الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق. ملاحظة: نقل الخلايا إلى وسائل الإعلام الجديدة يحسن من استنساخ النتائج.
2. إجراء تعداد خلايا والخلايا resuspend في كامل RPMI في 2 × 10 ⁶ جملتعلمي اللغة اإلنكليزية / مل.
3. تمييع الخلايا 1 في 2 مع BrdU كاملة RPMI إنتاج تركيز الخلية النهائي من 1 × 10 ⁶ خلية / مل.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5٪ لمدة 45 دقيقة، ثم تمييع الخلايا 1 في 10 مع كامل RPMI. خلايا الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق وبعناية تجاهل كل من طاف.
5. Resuspend الخلايا في حجم صغير (~ 100 ميكرولتر) لاستكمال RPMI، بإجراء عدد خلايا والتكيف مع 1 × 10 ⁶ خلية / مل.
6. ماصة 1 مل من الخلايا في الآبار من 48 لوحة جيدا. ماصة 1 مل من DPBS إلى أية آبار غير مأهولة للحصول على نتائج أكثر استنساخه.
7. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ في الهواء لمدة timepoints المطلوب، هنا 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 13، 14، 15، 16، 17 ، 18، 19، 20، 21، 22، 23، و 24 ساعة. ملاحظة: إن طول الفترة الزمنية تعتمد على ما يهدف التصميم التجريبي لقياس.
8. نقل جميع الخلايا في أنابيب FACS باستخدام ماصة. شطف بالتتابع جيدا مع 1 مل voluMES من برنامج تلفزيوني إلى الحجم الكلي النهائي من 5 مل.
9. أجهزة الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة بعناية كل طاف. الخلايا جاهزة للتلوين، تؤدي هذه (القسم 4) على الفور.

تلطيخ 4. خلية

ملاحظة: إذا كان مطلوبا تلطيخ سطح الخلايا تنفيذ ذلك قبل التثبيت، وضمان أن الخلايا يتم الاحتفاظ في 4 ° C طوال الوقت.

1. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (لتلطيخ السطح اختياري، إضافة حجم الموصى بها من الأجسام المضادة على سطح المستضدات واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية).
2. إضافة 1 مل من العازلة تلطيخ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 150 x ج وتجاهل طاف.
   ملاحظة: الأجسام المضادة النوعية والتركيز، وفترة حضانة وما إلى ذلك سوف يختلف وفقا لأهداف تجريبية محددة.
3. تثبيت وPermeabilization
   1. الخلايا resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة التثبيت واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إضافة 1 مل سو غسل العازلة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 150 x ج وتجاهل طاف.
   3. الخلايا resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة على الجليد.
   4. إضافة 1 مل من غسل العازلة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 150 x ج، وتجاهل طاف.
   5. الخلايا resuspend في 100 ميكرولتر من تثبيت العازلة في أنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. إضافة 1 مل من غسل العازلة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 150 x ج، وتجاهل طاف.
      ملاحظة: يمكن إيقافها مؤقتا بروتوكول هنا إذا لزم الأمر. خلايا ثابتة مستقرة لعدة أيام في 4 درجات مئوية إذا معلق في المخزن تلطيخ. إزالة المنطقة العازلة تلطيخ التالية الطرد المركزي قبل المتابعة.
4. الدناز العلاج
   1. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول الدناز (30 ميكروغرام من الدناز / 10 ⁶ خلايا)، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
   2. إضافة 1 مل من غسل العازلة، الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
5. تلوين الأجسام المضادة
   ملاحظة: تلطيخ لعلامات داخل الخلايا الأخرى من BrdU لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع تلطيخ BrdU.
   1. هام: إعداد ضوابط التعويض يتألف من خلايا غير ملوثين والخلايا المسمى مع كل تألقي واحد. من الناحية المثالية، استخدام نفس الأجسام المضادة للضوابط التعويض عن تلك المستخدمة في أنابيب التجريبية. ومع ذلك، إذا لم يكن ذلك ممكنا، والأجسام المضادة بديلة لمستضدات أعرب غاية مترافق إلى نفس تألقي.
   2. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من غسل العازلة وإضافة 1 ميكرولتر / 10 ⁶ خلايا BrdU الأجسام المضادة. ملاحظة: يمكن أيضا الأجسام المضادة مترافق مباشرة إلى غيرها من مستضدات الخلايا المحددة تضاف.
      ملاحظة: الأجسام المضادة للهيستون H3 فسفرته على Ser10 يمكن استخدامها للتمييز بين الخلايا في G2 وM، هيستون H3 هو مفسفر على Ser10 خلال الانقسام ¹⁰ أضداد cdc2 مفسفر على Tyr15 يمكن استخدامها للكشف عن الخلايا التي هفالبريد ملتزمون الانقسام. ¹¹
   3. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   4. إضافة 1 مل من غسل العازلة، والخلايا الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.

6. DNA وصمة عار لتحليل دورة الخلية
   1. تخفيف بيليه وإضافة 20 ميكرولتر من الحل 7-AAD (0.25 ميكروغرام). ملاحظة: فمن الأهمية بمكان أن استخدام كمية ثابتة من 7 AAD / خلية.
   2. resuspend الخلايا في 1 مل من العازلة تلطيخ.

5. جمع بيانات التدفق الخلوي

ملاحظة: الجهاز المطلوبة تعتمد على عدد وطبيعة fluorochromes المستخدمة.

1. جمع المعلمات التالية: FSC-A، SSC-A، FSC-H (FSC-W يمكن أن تستخدم بدلا من FSC-H) و 7 AAD مضان على مقياس خطي. جمع القناة APC على نطاق السجل. جمع أي قنوات إضافية مطلوبة لتقييم السطحية أو الداخلية التسميات باستخدام مقياس السجل.
2. أداء كومpensation تداخل الإشارات في أطياف الانبعاثات لوحظ بين fluorochromes مختلف قبل تحليل العينات. ملاحظة: معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي تنفيذ هذا تلقائيا.
3. جمع ما لا يقل عن 10000 الأحداث لكل عينة.

6. تحليل التدفق الخلوي البيانات

ملاحظة: تم استخدام FlowJo في هذه الدراسة لتحليل التدفق الخلوي البيانات ولكن حزم البرامج الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا. ويتضح الاستراتيجية النابضة في الشكل 1.

1. تحديد السكان خلية قابلة للحياة باستخدام FSC-A وSSC-A المعلمات.
2. ضمن هذه الفئة من السكان استبعاد الحلل والركام باستخدام FSC-A وFSC-H (FSC-W يمكن أن تستخدم أيضا هنا).
3. ضمن هذه الفئة من السكان تعيين مؤامرة نقطة باستخدام 7-AAD على محور س وBrdU-APC على المحور الصادي.

الشكل 1: استراتيجية المحاصرة اليسار سنويا.نيل: وتظهر الخلايا ungated على FCS-A مقابل SSC-A مؤامرة نقطة. يتم التعرف على السكان خلية قابلة للحياة بوابة مبين. وتظهر الخلايا المغلقة من لوحة اليسرى على FSC-A مقابل FSC-H مؤامرة نقطة (يمكن استخدامها بدلا من ارتفاع FSC-W): مركز اللوحة. يتم تحديد الحلل والركام، ويستثنى من الباب مبين. اللوحة اليمنى: وتظهر الخلايا المغلقة من تاريخ الاستبعاد صدرة في لوحة مركز على 7-AAD مقابل APC-A مؤامرة نقطة. هو المسمى الضد BrdU مع APC يتيح التعرف على الخلايا التي أدرجت BrdU خلال وضع العلامات النبض. تقدم 7-AAD معلومات عن محتوى الحمض النووي. وتعرف بوابة العليا خلايا إيجابية لBrdU وبالتالي في المرحلة S في وقت نبض BrdU، البوابة اليسرى السفلى، والخلايا في G _0/1 والبوابة اليمنى السفلى تلك الموجودة في G ₂ / M. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. دورة الخلية A nalysis
   1. فتح ملف البيانات الأولى وبوابة على الخلايا في البوابة صدرة الاستبعاد.
   2. تحليل هذه الفئة من السكان لتوزيع دورة الخلية (الموجود ضمن منصات في مجال البرمجيات FloJo) واستخدام نموذج دين-جيت-فوكس.
   3. الحصول على مواقف G _0/1 وG ₂ / M قمم باستخدام إنشاء البوابات.
   4. بوابة على خلايا BrdU إيجابية وتخضع هذه الفئة من السكان لنفس التحليل دورة الخلية.
   5. توفير مواقف للG _0/1 وG ₂ / M قمم من خلال تطبيق نفس البوابات من إنشاء البوابات ووضع القيود (باستخدام البوابات خلق) لمواقف G _0/1 وG ₂ / M القمم. ويتضح ذلك في لوحات 2 الأولى من الشكل 2.
      ملاحظة: يمكن أيضا برامج أخرى يمكن استخدامها لتحليل البيانات وان تعليمات تختلف وفقا لذلك.

840 / 52840fig2highres.jpg "العرض =" 700 "/>
وبوابات تقدم دورة الخلية الفريق الأول (جميع خلايا) على السكان الخلية التي حددها بوابة صدرة الاستبعاد: الرقم 2. تم عرض هذه الفئة من السكان في الرسم البياني مع 7-عاد على المحور X. يشار إلى ذروة G _0/1 الذروة التي كتبها السهم الموجود أسفل المحور. في لوحات لاحقة تم بوابات الخلايا إيجابية BrdU على النحو المبين في الشكل رقم 1. يتم تطبيق قيمة _لل0/1 موقف G الحصول عليها عندما المعزولة من بوابة صدرة الإقصاء للخلايا BrdU إيجابية بوابات داخل FlowJo برنامج دورة الخلية. تم بوابات كل لوحة لاحقة على السكان إيجابي BrdU كما هو مبين في الشكل (1) وموقف G _0/1 الذروة على أساس القيمة التي تم الحصول عليها عند تحليل جميع السكان كما هو موضح في لوحات الأولين. باستخدام جزء سلبي BrdU لتحديد الموقع من السكان G _0/1 للخلايا إيجابية BrdU في نفس عصيدةلو تسيطر لأي الاختلافات الطفيفة في كثافة وصمة عار الحمض النووي بين العينات. الرقم الظاهر في كل لوحة يمثل الوقت منذ انتهاء نبض BrdU. وترد محسوبة مراحل دورة الخلية باللون الأخضر مظللة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

ويمكن استخدام هذه المنهجية للحصول على مجموعة من المعلومات. وترد عدد قليل من الطلبات هنا.

تقييم مدة دورة الخلية

لتحديد الوقت اللازم للخلايا إلى المرور عبر دورة الخلية، ويتم حصاد الخلايا في نق?...

Discussion

القدرة على تحليل دورة الخلية هي مهمة لفهم بيولوجيا السرطان وآلية عمل كل من المخدرات والجينات التي تؤثر على تكاثر الخلايا والنمو. في حين أن هناك العديد من المقايسات التي يقال قياس تكاثر الخلايا، فإن الغالبية لا توفر سوى مقياس يشير إلى خلايا العدد الحالي. وتشمل هذه الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC BrdU Flow Kit	BD Biosciences	552598	Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm Buffer (referred to as Fixation Buffer)
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	Referred to as Permeabilization buffer
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	Referred to as Wash buffer
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75 mm FACS tubes	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA flow cytometer	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Fetal Bovine Serum	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamine	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-deoxyuridine	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150 cm2 vented Flasks	BD Biosciences	355001
Pipettes 25 ml	Greiner	760180
Aersol Pipettes 200 µl	Interpath	24700
Aersol Pipettes 1 ml	Interpath	24800
Centrifuge	Spintron	GT-175R
CO2 incubator	Binder	C 150
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody	Cell Signalling	9708S
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb	Cell Signalling	2197S
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb	Cell Signalling	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128