تقييم خيط عضلي كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; الحساسية الكامنة وراء القلب الإثارة، تقلص اقتران

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

فشل القلب وعدم انتظام ضربات القلب هي الأسباب الرئيسية للأمراض والوفيات في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، لا تزال الآلية المرضية وعطل عضلة القلب في القلب المريضة إلى توضيح كامل. يوضح أدلة دامغة مؤخرا أن التغيرات في حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ تؤثر على الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ الأنشطة التوازن والقناة الايونية في myocytes القلب، والآليات الأساسية المسؤولة عن إمكانات العمل القلب وانقباض في قلوب سليمة والمريضة. في الواقع، أنشطة القنوات الأيونية والنقل الكامنة إمكانات العمل القلب (على سبيل المثال، ^{الصوديوم،} الكالسيوم ²⁺ و K ⁺ القنوات ونا ⁺ -CA ²⁺ مبادل) والكالسيوم ²⁺ التعامل مع البروتينات داخل الخلايا (على سبيل المثال، ryanodine المستقبلات والكالسيوم يتم قياس ²⁺ -ATPase في شبكية الهيولى العضلية (SERCA2a) أو فسفولامبان والفسفرة به) تقليديا إلى evaluيأكل من الآليات الأساسية للالقلب اقتران الإثارة، تقلص (EC). كل من الأنشطة الكهربائية في الغشاء والتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ هي إشارات الزناد من اقتران EC، في حين خيط عضلي هو وحدة وظيفية من التقلص والاسترخاء، وحساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ أمر لا بد منه في تنفيذ الأداء ييفة عضلية. ومع ذلك، عدد قليل من الدراسات تتضمن حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ في التحليل الوظيفي لعضلة القلب إلا إذا كان التركيز في الدراسة. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يقيس قسيم عضلي تقصير / إعادة إطالة والخلايا مستوى الكالسيوم ²⁺ باستخدام Fura 02:00 (كشف ratiometric) وتقييم التغييرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ في myocytes القلب من قلوب الفئران. والهدف الرئيسي هو التأكيد على أنه خيط عضلي ينبغي أن تؤخذ حساسية الكالسيوم ²⁺ بعين الاعتبار في اقتران EC للتحليل الآلية. تحقيق شامل طعلى قنوات، نقل أيون، داخل الخلايا معالجة الكالسيوم ^2+، وحساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ التي تكمن وراء انقباض العضلية في قلوب سليمة والمريضة سوف توفر معلومات قيمة عن تصميم استراتيجيات أكثر فعالية من متعدية وقيمة علاجية.

Introduction

القلب الإثارة، تقلص (EC) اقتران هو مخطط أساسي لتحليل الخواص الميكانيكية للعضلة القلب، أي وظيفة مقلص من القلب ^1،2. يبدأ اقتران المفوضية الأوروبية من خلال الاستقطاب غشاء الثانوي لأنشطة القنوات الأيونية sarcolemmal (على سبيل المثال، نا ⁺ قناة بوابات الجهد، والتي يمكن قياسها عبر تقنيات التصحيح، المشبك). تفعيل لاحق من الجهد بوابات L من نوع كا ²⁺ قنوات (LTCCs) والكالسيوم ²⁺ تدفق عبر LTCCs تؤدي الجزء الأكبر من الكالسيوم ²⁺ الإفراج خلال ryanodine المستقبلات (RyRs)، وزيادة عصاري خلوي تركيز الكالسيوم ²⁺ من nanomolar (نانومتر ) إلى مكرومولي مستوى (ميكرومتر). هذه الزيادة في كاليفورنيا عصاري خلوي ²⁺ يعزز الكالسيوم ²⁺ ملزمة لتروبونين C (المجلس الوطني الانتقالي) في خيوط رقيقة ويثير التغيرات متعلق بتكوين مجمع خيوط لتسهيل التفاعل بين الأكتين الميوسين ومن بلوغ myocardi انكماش ال ^3. على العكس، فإن الكالسيوم عصاري خلوي ²⁺ وإعادة المستحوذ ظهر في شبكية الهيولى العضلية (SR) من خلال كا ²⁺ -ATPase في ريال (SERCA2a) أو مقذوف من العضلية عن طريق نا ⁺ / كا ²⁺ المبادلات والبلازمي كاليفورنيا ²⁺ أتباز ^1،2. ونتيجة لذلك، وانخفاض في الكالسيوم عصاري خلوي ²⁺ يحرض التغييرات متعلق بتكوين خيوط رقيقة العودة إلى حالته الأصلية، مما أدى إلى تفكك الأكتين، الميوسين والعضلية الاسترخاء ^1-3. في هذا المخطط، ويعتبر هذا النشاط من SERCA2a عموما لتحديد سرعة الاسترخاء عضلة القلب لأنه يشكل 70 - 90٪ من عصاري خلوي إزالة الكالسيوم ²⁺ في معظم خلايا القلب الثدييات ^1. على هذا النحو، والشاذ الكالسيوم ²⁺ معالجة من قبل LTCC، RYR وSERCA2a، وما إلى ذلك اعتبرت الآليات الرئيسية لانقباض ضعف واسترخاء في قلب المريضة ^1-4.

> في الواقع، مجانا عصاري خلوي كا ²⁺ أن وظائف كما قال رسول في حسابات اقتران EC لحوالي 1٪ من مجموع الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ والغالبية من الكالسيوم ²⁺ لا بد أن الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ مخازن ^5،6. هذا ويرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من الكالسيوم ²⁺ مخازن وفيرة في myocytes القلب، على سبيل المثال، الفوسفورية غشاء، ATP، فسفوكرياتين، كالمودولين، parvalbumin، ييفة عضلية الشركات عبر الوطنية، الميوسين، SERCA2a، وكالسيكويسترين في ريال ^5،6،7. من بينها، SERCA2a والشركات عبر الوطنية هي السائدة الكالسيوم ²⁺ مخازن ^5،6،7. وعلاوة على ذلك، الكالسيوم ²⁺ ملزمة لالمخازن المؤقتة الخاصة به هو عملية ديناميكية خلال نشل (على سبيل المثال، 30-50٪ من الكالسيوم ²⁺ بربط الشركات عبر الوطنية وتنفصل منه خلال كا ²⁺ العابرين ⁷⁾ والتغيير في كا ²⁺ سبب إضافي ملزم "الافراج" حرية الكالسيوم ²⁺ إلى العصارة الخلوية، والنتائج في التعديلات من الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ اضربentration. ونتيجة لذلك، الاضطراب داخل الخلايا مستوى الكالسيوم ²⁺ يدفع الحركات خيط عضلي غير طبيعي، والتي هي السلائف من ضعف مقلص وعدم انتظام ضربات القلب ^8،9. عوامل كثيرة (كلا الفسيولوجية والمرضية) يمكن أن تكون مصادر تعديلات ما بعد النسخي من البروتينات خيط عضلي، التي تؤثر على خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ التخزين المؤقت وخيط عضلي الكالسيوم ²⁺ حساسية ^8-10. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الطفرات في البروتينات خيط عضلي زيادة الكالسيوم ²⁺ تقارب ملزمة والخلايا معالجة الكالسيوم ^2+، مما اثار التقوية التي تعتمد على وقفة من الكالسيوم ²⁺ العابرين، والشاذ الكالسيوم ²⁺ الإفراج عنهم، وعدم انتظام ضربات القلب ^8. وتماشيا مع هذا المفهوم، لقد أظهرنا أيضا أن خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ الحساسية في قلوب الفئران ارتفاع ضغط الدم الثانوي ليصل تنظيم الخلايا العصبية سينسيز أكسيد النيتريك يرتبط ضغط الدم الانبساطي مرتفعة والانقباضي الكالسيوم ²⁺ المستويات^11، والذي بدوره يزيد من ضعف LTCC إلى الكالسيوم ²⁺ تثبيط معتمد على ^12. وبالتالي، حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ هو منظم "نشطا" من الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ التوازن والعضلية وظيفة مقلص. أصبح من الضروري لتحليل التفاعلات بين خيط عضلي والكالسيوم ²⁺ التعامل مع البروتينات لتحقيق شامل في العضلية اقتران EC وظيفة القلب.

هنا، نحن تصف البروتوكول الذي يقيم التغييرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ في myocytes القلب المعزولة. تحليل شامل للالكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ الشخصي، وخيط عضلي الكالسيوم ²⁺ حساسية والانكماش كشف آليات جديدة الميكانيكا عضلة القلب الكامنة.

Protocol

البروتوكول هو وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للأمم المتحدة للصحة (NIH المنشور رقم 85-23، منقحة 1996). تم الموافقة عليها من قبل اللجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) من جامعة سيول الوطنية (موافقة IACUC أي: جامعة سول الوطنية-101213-1).

1. إعداد العازلة (مواد الجدول والمعدات)

1. إعداد 300 مل من محلول عزلة جديدة على يوم من التجربة (في ملي: كلوريد الصوديوم، 135، بوكل، 5.4، MgCl _2، 3.5، الجلوكوز، 5؛ HEPES، 5؛ نا ₂ هبو _4، 0.4، التورين، 20؛ الرقم الهيدروجيني 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
2. إعداد 100 مل من محلول تخزين جديدة على يوم من التجربة (في ملي: كلوريد الصوديوم 120، بوكل 5.4، MgSO ₄ 5؛ CaCl ₂ 0.2، الصوديوم البيروفات 5؛ الجلوكوز 5.5، التورين 20؛ HEPES 10؛ مانيتول 29؛ ودرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
3. تحضير 1L من حل نضح (في ملي: كلوريد الصوديوم، 141.4، بوكل، 4؛ ناه ₂ ص _4، 0.33، MGCل _2، 1؛ HEPES، 10؛ الجلوكوز، 5.5، CaCl _2، 1.8، مانيتول، 14.5، 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم).
4. إعداد 30 مل من محلول كولاجيناز 1 بإضافة كولاجيناز (1 ملغ / مل)، البروتيني (0.1 ملغ / مل)، ألبومين المصل البقري (BSA، 1.67mg / مل)، والكالسيوم ²⁺ (0.05 ملم) إلى 25 مل من العزلة حل.
5. إعداد 20 مل من محلول كولاجيناز 2 بإضافة كولاجيناز (1 ملغ / مل)، BSA (1.67 ملغ / مل)، والكالسيوم ²⁺ (0.05 ملم) إلى 16.7 مل من محلول العزلة.
6. إعداد 40 مل من محلول BSA بإضافة 0.4 غرام من BSA إلى 40 مل من محلول العزلة. فصل 10 مل و 30 مل إلى قسمين الأكواب. إضافة الكالسيوم ²⁺ إلى 30 مل من محلول BSA بحيث النهائي الكالسيوم ²⁺ التركيز في حل جيش صرب البوسنة هو 1 ملم.

2. إعداد لعزل البطين الأيسر (LV) Myocytes

1. نقل 8-12، ذكور فئران قبل أسبوع سبراغ داولي (SD) في أقفاص النقل النظيفة من منشأة الحيوان إلى غرفة التحضير والعزلة.
2. Hأكل اثنين من حمامات المياه إلى 37 ^{درجة مئوية.}
   ملاحظة: استخدام حمام مائي واحد للمياه - خزان تغلف وأنابيب نضح من نظام الارواء Langendorff. استخدام حمام مائي آخرين للتحريض جذوع أنسجة عضلة القلب وذلك لفصل myocytes واحدة.
3. إضافة 5 مل و 3.3 مل من محلول BSA (بدون الكالسيوم ²⁺⁾ إلى 25 مل من محلول كولاجيناز 1 و 16.7 مل كولاجيناز الحل 2 لتعويض حجم 30 مل و 20 مل، على التوالي.
4. إضافة حل العزلة (100 مل)، وحل كولاجيناز 1 (30 مل) إلى العمود 1 (العقيد 1) والعمود 2 (العقيد 2) في نظام Langendorff نضح، على التوالي (الشكل 1A).
5. الأوكسجين في حل العزلة وحل كولاجيناز 1 في العقيد 1 وCol.2 عبر أنبوب توصيل الأكسجين في النظام نضح Langendorff (الشكل 1A). وبالمثل، الأوكسجين حل كولاجيناز 2 وحل جيش صرب البوسنة في حمام مائي تهتز مع 100٪ O ₂ عن طريقأنبوب توصيل الأكسجين.

3. عزل LV Myocytes

1. تخدير الفئران SD عن طريق الحقن داخل الصفاق من الصوديوم بنتوباربيتال (30 ملغ / كلغ) وتأكد من حالة التخدير التي كتبها اصبع القدم معسر وعدم وجود انعكاس الانسحاب.
2. نقل الفئران إلى علبة تشريح. في موقف ضعيف، وتأمين أربع أرجل على الجانبين من الجسم مع الشريط.
3. تطبيق الصدري شقوق منتصف محوري مع مقص جراحي لفتح الصدر، وضمان عدم تلف القلب. استخدام زوج آخر من مقص نظيفة لتشريح القلب من الأوعية التي تربط (على سبيل المثال، متفوقة والوريد الأجوف السفلي، الأوعية الرئوية، والشريان الأورطي) وغشاء التامور ^13.
4. ترك جزء من الشريان الأورطي لمدة كافية (5-8 ملم)، المشبك الأبهر مع ملقط غرامة، وجبل بسرعة قنية من نظام الارواء Langendorff حدود 1 دقيقة (الشكل 1A). ربط خيوط الجروح 4/0 بإحكام على الشريان الأورطي.
تشغيل صمام على العقيد 1 ويروي قلب معزولة مع حل العزلة قبل تحسنت والاوكسيجين لمدة 10 دقيقة (معدل نضح: 12-14 مل / دقيقة). إيقاف صمام على العقيد 1، بدوره على صمام على العقيد (2) ويروي القلب مع حل كولاجيناز 1 ل8-10 دقيقة.
5. ترجل قلب هضمها من قبل قطع الشريان الأورطي ونقلها من خلال عقد الشريان الأورطي مع ملقط في قارورة تحتوي على حل العزلة الطازجة (الشكل 1Bi). استخدام مقص الجميلة وملقط لقطع معظم الجدار الحر LV (بما في ذلك الحاجز) إلى أجزاء أصغر (~ 22 ملم، الشكل 1Bii).
6. نقل القطع في قارورة تحتوي على قبل تحسنت والاوكسيجين كولاجيناز جديدة الحل 2 (الشكل 1Biii). يهز لمدة 10 دقيقة. استمرار في تقديم الأكسجين إلى التي تحتوي على العضلية كولاجيناز حل 2.
7. نقل العضلية - تعليق لأنبوب 10 مل الطرد المركزي باستخدام القطارات مع لمبة الشفط وإضافة الكالسيوم ²⁺ - تحتوي على حل جيش صرب البوسنة (1: 1 في الحجم). أجهزة الطرد المركزي في 30 جرام لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. إعادة تعليق بيليه العضلية في 5 مل من محلول BSA. الطرد المركزي وتجاهل طاف.
8. تفريق الكريات العضلية والحفاظ على myocytes في 10 مل من محلول التخزين المؤكسج قبل في RT (الشكل 1Biv الى السادس).
9. كرر الإجراءات (الخطوات 3،7-3،9) مع النسيج LV المتبقية في القارورة.
   ملاحظة: الحفاظ على تكرار الإجراءات (الخطوات 3،7-3،9) مرة أخرى حتى معظم الأنسجة LV يختفي في الحصول على عائد جيد من myocytes.
10. الحفاظ على myocytes في حلول التخزين لمدة 6-8 ساعة على RT حتى نهاية التجارب.

4. القياسات في وقت واحد من الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ العابرون والعضلية تقلص

1. myocytes تحميل LV مع acetoxymethyl استر FURA-02:00 (2 ميكرومتر).
   ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات التحميل والتجارب مع myocytes محملة في أنبوب الظلام (الشكل 1Bvii).
   1. الطرد المركزيifuge تعليق العضلية (1 مل) في 2000 x ج لمدة 10 ثانية. تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه العضلية في 1 مل من محلول تايرود مع انخفاض الكالسيوم ²⁺ تركيز (250 ميكرومتر، مواد الجدول والمعدات).
   2. إضافة FURA-02:00 وبولوكسامير 407 (2 ميكرولتر)، تفريق بلطف تعليق العضلية، والحفاظ على الخليط في RT (20-24 ^درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة (الشكل 1Bvii).
   3. الطرد المركزي الخليط لمدة 5 ثوان، تجاهل طاف وتفريق بيليه العضلية في 1 مل من محلول الارواء تحتوي على 500 ميكرومتر الكالسيوم ^2+. بعد 10 دقيقة، الطرد المركزي الخليط لمدة 5 ثانية وتجاهل طاف.
   4. إضافة محلول الارواء الطازجة (500 ميكرومتر الكالسيوم ^2+، 1 مل) والحفاظ على FURA-02:00 - بيليه العضلية التي تم تحميلها في هذا الحل للتسجيلات.
2. قياس انكماش LV العضلية والكالسيوم داخل الخلايا ²⁺
   1. قبل التسجيل، وملء الأنبوب نضح أن يمر عبرسترة المياه مع حل تايرود، وهو قبل تحسنت إلى 36 ^{درجة مئوية.}
   2. ضع بضع قطرات من FURA 02:00 - تحميل LV تعليق العضلية على غرفة المجهر مضان مقلوب لمدة 5 - 8 دقائق. ببطء يروي الحل تايرود (2.2 مل / دقيقة).
   3. اضغط على زر "البدء" على اللوحة الأمامية للمحفز إصبعي لبدء التحفيز الميدان (2 هرتز).
      ملاحظة: انتاج التيار الكهربائي (10 فولت، 5 ميللي ثانية مدتها) وتطبيقها على myocytes في الغرفة من خلال أسلاك البلاتين المتمركزة على جانبي الغرفة.
      1. اختر myocytes أن العقد ثابت (لا تلك التي تعرض فرط أو قصور انكماش) ​​للتسجيل.
   4. ضبط العضلية من خيار في الوضع الأفقي للنظام الكشف قسيم عضلي القائم على الفيديو وضبط بؤرة المجهر للحصول على صور أفضل من ساركومير. ضع مربع مستطيل الأرجواني على المنطقة التي لوحظت ساركومير واضحة بوضوح حتى المتوسطمن أطوال قسيم عضلي (الذروة الحمراء) يعرض ذروة فريدة حادة (الشكل 2A، الصورة السفلى).
   5. تسجيل التغيرات في طول قسيم عضلي في الاستجابة لتحفيز الميدان (الشكل 2A وباء).
      ملاحظة: استخدم myocytes تحميل ضمن 1-2 ساعة.
   6. ضبط فتحة الكاميرا بحيث الحقل في نظام الكشف قسيم عضلي القائم على الفيديو هو حجم العضلية (الشكل 2A). تحفيز العضلية مع الإثارة في 360 نانومتر / 380 نانومتر، والانبعاثات في 510 نانومتر (تردد اقتناء 1000 هرتز). سجل تقصير قسيم عضلي ونسبة Fura2 AM مع التحفيز الميدان (الشكل 2B).

5. تقييم حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺

1. متوسط ​​أطوال قسيم عضلي والكالسيوم ²⁺ العابرين في حالة استقرار (10-20 آثار) ورسم حلقة مرحلة الطائرة من نسبة FURA-2 مقابل طول قسيم عضلي من نفس العضلية (على حد سواء مع القيمة المقاسةالصورة ودلتا التغييرات، الشكل 2C).
2. في كل قطعة، وتحديد نسبة FURA -2 في 50٪ الاسترخاء (EC _50، الشكل 2C). مقارنة كل حلقة وEC ₅₀ من كل تدخل.

النتائج

يتم عزل myocytes LV من قلوب الفئران العادية وارتفاع ضغط الدم. تعتبر myocytes على شكل قضيب مع التصدعات واضحة (تمثل ساركومير) وتقلصات مستقرة وردا على التحفيز المجال ليكون myocytes الأمثل ويتم اختيارها للتسجيلات (الشكل 2A). في المثال الموضح في F igure 2A،

Discussion

هنا، نحن تصف بروتوكولات لتقييم التغيرات من حساسية خيط عضلي الكالسيوم ²⁺ في واحدة العضلية القلبية معزولة والتأكيد على أهمية قياس هذه المعلمة إلى جانب الخصائص الكهربية، الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ العابرين، وديناميات خيط عضلي. وذلك لأن التسجيلات واحدة أو اثن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM