Valutazione della myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento

Riepilogo

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

L'insufficienza cardiaca e aritmie cardiache sono le principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. Tuttavia, il meccanismo di patogenesi e malfunzionamenti miocardio nel cuore malato deve essere ancora pienamente chiariti. Prova convincente recente dimostra che i cambiamenti nel myofilament Ca ²⁺ sensibilità influenzano Ca ²⁺ intracellulare attività omeostasi e canali ionici in miociti cardiaci, i meccanismi fondamentali responsabili del potenziale d'azione cardiaco e la contrazione nei cuori sani e malati. Infatti, le attività di canali ionici e trasportatori sottostanti potenziali d'azione cardiaci (ad esempio, Na ^+, Ca ²⁺ e canali K ⁺ e Na ⁺ -Ca ²⁺ scambiatore) e Ca ²⁺ movimentazione proteine ​​intracellulari (ad es., Recettori rianodinici e Ca ²⁺ -ATPasi nel reticolo sarcoplasmatico (SERCA2a) o fosfolambano e la sua fosforilazione) sono convenzionalmente misurata condotta in basemangiato i meccanismi fondamentali di attacco cardiaco eccitazione-contrazione (EC). Entrambe le attività elettrica nella membrana e intracellulari Ca ²⁺ cambiamenti sono i segnali di attivazione di accoppiamento CE, che myofilament è l'unità funzionale di contrazione e rilassamento, e myofilament Ca ²⁺ sensibilità è indispensabile nella realizzazione di prestazioni myofibril. Tuttavia, pochi studi incorporano myofilament Ca ²⁺ sensibilità nell'analisi funzionale del miocardio a meno che non è al centro dello studio. Qui, descriviamo un protocollo che misura sarcomere accorciamento / ri-allungamento e il livello di intracellulare di Ca ²⁺ usando Fura-2 AM (rilevamento raziometrico) e valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità nei miociti cardiaci da cuori di ratto. L'obiettivo principale è quello di sottolineare che myofilament Ca ²⁺ sensibilità dovrebbe essere presa in considerazione in abbinamento CE per l'analisi meccanicistica. un'indagine completa di isui canali ionici, trasportatori, intracellulare di gestione di Ca ^2+, e myofilament Ca ²⁺ sensibilità che sono alla base dei miociti contrattilità nei cuori sani e malati fornirà informazioni preziose per la progettazione di strategie più efficaci di traslazione e valore terapeutico.

Introduzione

Cardiac accoppiamento eccitazione-contrazione (EC) è lo schema fondamentale per analizzare le proprietà meccaniche del miocardio, cioè, la funzione contrattile del cuore ^1,2. Accoppiamento CE è avviata da depolarizzazione della membrana secondaria alle attività di canali ionici sarcolemma (ad esempio, il canale Na ⁺ voltaggio-dipendenti, che può essere misurata mediante tecniche di patch-clamp). Successiva attivazione di voltaggio-dipendenti di tipo L Ca ²⁺ canali (LTCCs) e Ca ²⁺ afflusso tramite LTCCs innescare la maggior parte di Ca ²⁺ rilascio attraverso i recettori rianodinici (RyRs), aumentando la concentrazione citoplasmatica di Ca ²⁺ dal nanomolari (nm ) a livello micromolare (micron). Tale aumento di Ca ²⁺ citosolico promuove Ca ²⁺ legame troponina C (TNC) a filamenti sottili e suscita cambiamenti conformazionali del complesso filamento per facilitare l'interazione actina-miosina e myocardi raggiungeAl contrazione ^3. Viceversa, il citosolico Ca ²⁺ è ri-uptaken indietro nel reticolo sarcoplasmatico (SR) attraverso il Ca ²⁺ -ATPasi in SR (SERCA2a) o viene estrusa dalla miociti tramite la Na ⁺ / Ca ²⁺ scambiatore e la plasmalemmal Ca ²⁺ ATPasi ^1,2. Di conseguenza, il declino della Ca citosolico ^{2 +} istiga cambiamenti conformazionali di filamenti sottili di nuovo allo stato originale, con conseguente dissociazione di actina-miosina e miociti relax ^1-3. In questo schema, l'attività di SERCA2a è generalmente considerato per determinare la velocità di rilasciamento miocardico perché il 70 - 90% di citosolico rimozione Ca ²⁺ nella maggior cellule cardiache mammifero ^1. Come tale, anormale Ca ²⁺ movimentazione da LTCC, RyR e SERCA2a, ecc è stato considerato i meccanismi primari per contrattilità alterata e relax nel cuore malato ^1-4.

In realtà, libero citosolico Ca ²⁺ che funziona come il messaggero in conti di accoppiamento CE per circa l'1% del totale intracellulare di Ca ²⁺ e la maggior parte di Ca ²⁺ è destinata a intracellulari di Ca ²⁺ buffer ^5,6. Ciò è dovuto al fatto che i vari Ca ²⁺ buffer sono abbondanti in miociti cardiaci, ad esempio, i fosfolipidi di membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbumina, myofibril TnC, miosina, SERCA2a e calsequestrina nella SR. ^5,6,7. Tra questi, SERCA2a e TnC sono i predominanti Ca ²⁺ buffer ^5,6,7. Inoltre, Ca ²⁺ vincolante ai suoi buffer è un processo dinamico durante contrazione (ad esempio, 30-50% di Ca ²⁺ si lega a TnC e dissociare da esso durante Ca ²⁺ transitori ⁷⁾ e la variazione di Ca ²⁺ causa aggiuntiva vincolante "release" del libero Ca ²⁺ al citosol, i risultati nelle alterazioni della intracellulare Ca ²⁺ concentration. Di conseguenza, perturbazione del intracellulare livello di Ca ²⁺ induce movimenti myofilament anomali, che sono i precursori di disfunzione contrattile e aritmie ^8,9. Molti fattori (sia fisiologici e patologici) possono essere le fonti di modificazioni post-trascrizionali di proteine ​​myofilament, che influenzano myofilament Ca ²⁺ buffering e myofilament Ca ²⁺ sensibilità ^8-10. Recentemente, è stato riportato che le mutazioni nelle proteine ​​myofilament aumentano il Ca ²⁺ affinità di legame e intracellulare movimentazione Ca ^2+, innescando potenziamento pausa-dipendente di Ca ²⁺ transitori, rilascio anormale Ca ^2+, e aritmie ^8. In linea con questo concetto, abbiamo anche dimostrato che myofilament Ca ²⁺ desensibilizzazione nei cuori di ratto ipertesi secondari per l'up-regolazione di neuronale ossido nitrico sintasi è associata ad diastolica elevata e sistolica Ca ²⁺ livelli^11, che a sua volta, aumenta la vulnerabilità del LTCC Ca ²⁺ -dipendente inattivazione ^12. Quindi, myofilament Ca ²⁺ sensibilità è un regolatore "attivo" di intracellulare omeostasi e miociti funzione contrattile Ca ^2+. E 'diventato necessario analizzare le interazioni tra myofilament e Ca ²⁺ movimentazione proteine ​​per un'indagine approfondita di miociti accoppiamento CE e la funzione cardiaca.

Qui, descriviamo un protocollo che valuta i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità in isolate miociti cardiaci. Analisi completa di intracellulare Ca ²⁺ profilo, myofilament Ca ²⁺ sensibilità e la contrazione sarà scoprire nuovi meccanismi meccanici del miocardio sottostanti.

Protocollo

Il protocollo è in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicati dal National Institutes of Health delle Nazioni Unite (NIH Publication No. 85-23, rivisto 1996). E 'stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) di Seoul National University (approvazione IACUC no .: SNU-101.213-1).

1. Buffer Preparazione (Materiali e attrezzature Tabella)

1. Preparare 300 ml di soluzione di isolamento fresco il giorno dell'esperimento (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4, MgCl _2, 3,5, glucosio, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4, taurina, 20; pH 7,4 con NaOH).
2. Preparare 100 ml di soluzione di conservazione fresco il giorno dell'esperimento (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0.2; sodio piruvato 5; glucosio 5,5; taurina 20; HEPES 10; mannitolo 29; pH 7,4 con NaOH).
3. Preparare 1L di soluzione di perfusione (in mm: NaCl, 141.4, KCl, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MGCl _2, 1; HEPES, 10; glucosio, 5.5; CaCl _2, 1.8; mannitolo, 14.5; pH 7,4 con NaOH).
4. Preparare 30 ml di soluzione di collagenasi 1 aggiungendo collagenasi (1 mg / ml), proteasi (0,1 mg / ml), albumina di siero bovino (BSA, 1.67mg / ml), e Ca ²⁺ (0.05 mM) a 25 ml di isolamento soluzione.
5. Preparare 20 ml di soluzione di collagenasi 2 aggiungendo collagenasi (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml), e Ca ²⁺ (0.05 mM) di 16,7 ml di soluzione di isolamento.
6. Preparare 40 ml di soluzione di BSA aggiungendo 0,4 g di BSA a 40 ml di soluzione di isolamento. Separati da 10 ml e 30 ml in due bicchieri. Aggiungere Ca ²⁺ a 30 ml di soluzione di BSA in modo che la concentrazione finale di Ca ²⁺ nella soluzione BSA è 1 mM.

2. Preparazione per l'isolamento di ventricolare sinistra (LV) miociti

1. Trasferire 8-12 ratti Sprague-Dawley (SD) settimane di età, di sesso maschile in gabbie di trasporto puliti dal stabulario per la stanza di preparazione e l'isolamento.
2. Hmangiare due bagni di acqua a 37 ^° C.
   Nota: utilizzare il bagno uno di acqua per l'acqua - serbatoio camicia ed i tubi di perfusione del sistema di perfusione Langendorff. Utilizzare l'altro bagno d'acqua per agitare tronchi tessuto miocardico in modo da separare singoli miociti.
3. Aggiungere 5 ml e 3,3 ml di soluzione di BSA (senza Ca ²⁺⁾ a 25 ml di soluzione di collagenasi 1 e 16,7 ml di soluzione di collagenasi 2 per compensare il volume a 30 ml e 20 ml, rispettivamente.
4. Aggiungere soluzione di isolamento (100 ml) e soluzione di collagenasi 1 (30 ml) alla colonna 1 (Col. 1) e la colonna 2 (Col. 2) nel sistema Langendorff perfusione, rispettivamente (Figura 1A).
5. Ossigenare la soluzione di isolamento e soluzione di collagenasi 1 nella Colonna 1 e Col.2 tramite il tubo di collegamento ossigeno nel sistema di perfusione Langendorff (Figura 1A). Analogamente, soluzione di collagenasi ossigenato 2 e la soluzione BSA nel bagnomaria agitazione con 100% O ₂ tramitetubo di collegamento di ossigeno.

3. Isolamento di LV miociti

1. Anestetizzare un ratto SD tramite iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (30 mg / kg) e confermare lo stato anestetico da punta pizzicare e la mancanza di recesso riflessione.
2. Spostare il ratto di un vassoio dissezione. Nella posizione supina, fissare le quattro gambe ai lati del corpo con nastro.
3. Applicare incisioni metà assiale del torace con le forbici chirurgiche per aprire il torace, assicurando di non danneggiare il cuore. Utilizzare un altro paio di forbici pulite per sezionare il cuore dai vasi di collegamento (ad esempio, superiore e vena cava inferiore, vasi polmonari, e l'aorta) e la membrana pericardica ^13.
4. Lasciare una porzione dell'aorta di lunghezza sufficiente (5 - 8 mm), bloccare l'aorta con pinza sottile, e rapidamente montare la cannula del sistema di perfusione Langendorff entro 1 min (Figura 1A). Tie filo di sutura 4/0 strettamente sopra l'aorta.
5. accendere la valvola sul Col. 1 e profumato cuore isolato con soluzione di isolamento pre-riscaldato e ossigenato per 10 min (velocità di perfusione: 12-14 ml / min). Spegnere la valvola Col. 1, attivare la valvola sul Col. 2 e profumato il cuore con soluzione di collagenasi 1 per 8 - 10 min.
6. Smontare il cuore digerita tagliando l'aorta e trasferirla tenendo l'aorta con una pinza nel pallone contenente soluzione di isolamento fresco (Figura 1BI). Usare le forbici sottili e pinze per tagliare la maggior parte della parete libera LV (compreso il setto) in pezzi più piccoli (~ 22 mm, Figura 1Bii).
7. Trasferire i pezzi in un pallone contenente soluzione di collagenasi fresca pre-riscaldato e ossigenata 2 (figura 1Biii). Agitare per 10 min. Mantenere fornire ossigeno alla soluzione di collagenasi miociti contenente 2.
8. Spostare il miociti - sospensione in una provetta da 10 ml centrifuga using contagocce con un bulbo di aspirazione e aggiungere Ca ²⁺ - contenente soluzione di BSA (1: 1 in volume). Centrifugare a 30 g per 2 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet miociti in 5 ml di soluzione di BSA. Centrifuga e scartare il surnatante.
9. Disperdere il pellet miociti e tenere miociti in 10 ml di soluzione di storage pre-ossigenato a temperatura ambiente (Figura 1Biv-VI).
10. Ripetere le procedure (passi 3.7 - 3.9) si con il restante tessuto LV nel pallone.
    Nota: Mantenere ripetendo le procedure (punti 3.7 - 3.9) si ancora fino maggior parte del tessuto LV scompare per ottenere una buona resa di miociti.
11. Mantenere i miociti in soluzione di archiviazione per 6-8 ore a temperatura ambiente fino alla fine degli esperimenti.

4. Le misurazioni simultanee di intracellulari Ca ²⁺ transitori e miociti Contrazione

1. miociti carico LV con la acetossimetil estere Fura-2 AM (2 micron).
   Nota: eseguire tutte le operazioni di carico e gli esperimenti con i miociti caricato in un tubo scuro (Figura 1Bvii).
   1. Centrifuge sospensione miociti (1 ml) a 2.000 xg per 10 sec. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet miociti in 1 ml di soluzione Tyrode con una bassa concentrazione di Ca ²⁺ (250 micron, materiali e attrezzature tabella).
   2. Aggiungere Fura-2 del mattino e polossamero 407 (2 ml), disperdere delicatamente la sospensione dei miociti, e mantenere la miscela a temperatura ambiente (20 - 24 ^° C) per 15 minuti (Figura 1Bvii).
   3. Centrifugare la miscela per 5 sec, scartare il surnatante e disperdere il pellet miociti in 1 ml di soluzione di perfusione contenente 500 mM Ca ^2+. Dopo 10 minuti, centrifugare la miscela per 5 secondi e scartare il surnatante.
   4. Aggiungere la soluzione perfusione fresco (500 mM Ca ^2+, 1 ml) e mantenere il Fura-02:00 - pellet miociti caricata in questa soluzione per registrazioni.
2. Misura di LV miociti contrazione e intracellulare di Ca ²⁺
   1. Prima di registrare, riempire il tubo perfusione che attraversa uncamicia d'acqua con la soluzione Tyrode, che è pre-riscaldata a 36 ^o C.
   2. Mettere qualche goccia della Fura 02:00 - loaded sospensione dei miociti LV sulla camera di un microscopio a fluorescenza invertito per 5-8 min. Lentamente profumato la soluzione di Tyrode (2,2 ml / min).
   3. Premere il tasto "start" sul pannello frontale del stimolatore digitale per avviare stimolazione del campo (2 Hz).
      Nota: La tensione di uscita (10 V, 5 msec durata) è applicato al miociti nella camera attraverso fili di platino posizionate su entrambi i lati della camera.
      1. Selezionare i miociti che si contraggono in modo stabile (non quelli visualizzazione iper o ipo-contrazione) per la registrazione.
   4. Regolare la miociti di scelta nella posizione orizzontale del sistema di rilevazione sarcomero basato su video e regolare la messa a fuoco del microscopio per ottenere immagini ottimali di sarcomeri. Posizionare la scatola rettangolare viola sulla zona in cui sarcomeres chiari sono chiaramente rispettati solo alla mediadi lunghezze sarcomero (picco rosso) mostra un picco singolare affilato (Figura 2A, immagine in basso).
   5. Registrare le variazioni di lunghezza sarcomero in risposta alla stimolazione del campo (Figura 2A e B).
      Nota: utilizzare i miociti caricati entro 1 - 2 ore.
   6. Regolare il diaframma della telecamera in modo che il campo nel sistema di rilevazione sarcomere video-based è la dimensione della miociti (Figura 2A). Stimolare la miociti con eccitazione a 360 nm / 380 nm ed emissione a 510 nm (frequenza di acquisizione 1.000 Hz). Record accorciamento sarcomere e il rapporto Fura2 AM con stimolazione del campo (Figura 2B).

5. Valutazione di myofilament Ca ²⁺ Sensibilità

1. La media dei lunghezze sarcomero e Ca ²⁺ transitori a stato stazionario (10 - 20 tracce) e tracciare il ciclo di fase piano del rapporto di Fura-2 rispetto alla lunghezza del sarcomero dello stesso miociti (entrambe con valore misuratoS e delta cambi; Figura 2C).
2. In ogni trama, definire il rapporto Fura -2 al relax% 50 (EC _50, Figura 2C). Confronto sia il loop e EC ₅₀ di ogni intervento.

Risultati

miociti LV sono isolati da normali e ipertesi cuori di ratto. Miociti a forma di bastoncello con striature chiare (che rappresenta sarcomeri) e contrazioni stabili in risposta alla stimolazione campo sono considerati come i miociti ottimali e sono selezionati per le registrazioni (Figura 2A). Nell'esempio illustrato in F IGURA 2A, un Fura 02:00 MOLLA LV miociti è posizionato orizzontalmente e la apertura della telecamera viene regolata in modo che i...

Discussione

Qui, descriviamo i protocolli per valutare i cambiamenti di myofilament Ca ²⁺ sensibilità in un'unica miociti cardiaci isolati e sottolineare l'importanza di misurare questo parametro insieme a proprietà elettrofisiologiche, intracellulari di Ca ²⁺ transitori, e la dinamica myofilament. Questo perché le registrazioni di uno o due dei parametri non possono spiegare i meccanismi sottostanti contrazione cardiaca e relax. A differenza dei metodi convenzionali che misurano miociti contrazione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM