肌丝的Ca评估<sup&gt; 2+</sup&gt;灵敏度潜在心脏兴奋收缩耦联

摘要

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

摘要

心脏衰竭和心律失常是全世界发病率和死亡率的主要原因。然而，在患病心脏发病和心肌故障的机制仍有待完全澄清。最近令人信服的证据表明，在肌丝^的 Ca ²⁺敏感性的变化会影响细胞内Ca ²⁺稳态和离子通道活动在心肌细胞，负责在健康和患病心脏心脏动作电位和收缩的主要机制。事实上，潜在的心脏动作电位（如钠^离子 ，钙^离子和钾^离子通道，钠⁺ -Ca ²⁺交换）和细胞内钙^离子处理的蛋白质（ 例如 ，兰尼碱受体和钙离子通道的活动和运输²⁺ -ATP酶肌浆网（SERCA2a的）或磷蛋白和磷酸化其）的常规测量evalu吃了心脏兴奋收缩（EC）耦合的基本机制。在细胞膜和细胞内钙^离子的变化包括电活动有兴奋收缩耦联的触发信号，而肌丝的收缩和舒张的功能单位，肌丝钙^离子敏感性是在肌原纤维性能的实施势在必行。然而，很少有研究纳入肌丝钙^离子敏感性到心肌的功能分析，除非它是研究的重点。在这里，我们描述了测量肌缩短/再延长使用的Fura-2 AM（比率检测），并评估肌丝^的 Ca ²⁺从大鼠心脏心肌细胞敏感性的变化，细胞内钙^离子水平的协议。其主要目的是强调肌丝钙^离子敏感性，应考虑到EC联轴器机械分析。我的全面排查对背后的健康和患病心脏肌细胞收缩将提供有价值的信息设计平移和治疗价值的更为有效的战略通道，离子转运，细胞内钙^离子处理和肌丝钙^离子敏感性。

引言

心肌兴奋收缩（EC）耦合是分析心肌， 即心脏^1,2的收缩功能的机械性能的根本方案。 EC耦合 ​​通过膜去极化继发于细胞膜离子通道的活动发起（ 例如，电压门控^钠通道，它可以通过膜片钳技术测量）。电压门控的L型的随后活化的Ca ²⁺通道（LTCCS）和Ca 经由 LTCCS ²⁺内流触发散装的Ca ²⁺通过兰尼碱受体（RyRs的）的释放，从纳摩尔提高胞质Ca ²⁺浓度（纳米）到微摩尔（μM）的水平。这种增加在细胞内钙^离子促进钙^离子结合在薄丝肌钙蛋白C（TNC）和抒发灯丝复杂的构象变化，促进肌动球蛋白相互作用和达到myocardi人收缩^3。相反，细胞内^钙重新摄取回SR中的肌质网（SR）通过^的 Ca ²⁺ -ATP酶（SERCA2a的），或者是通过 ^钠 / ^钙交换和质膜挤出肌纤维钙^离子 ATP酶^1,2。因此，在细胞内的Ca的下降²⁺指使细长丝的构象变化返回到原来的状态，从而导致肌动蛋白-肌球蛋白和肌细胞松弛^1-3的解离。在这个方案中，SERCA2a的活性通常被认为是，以确定心肌松弛的速度，因为它占70 -在大多数哺乳动物的心脏细胞¹细胞内的Ca ²⁺去除的90％。正如LTCC，碱受体和SERCA2a的等这样的，不正常的^钙处理一直被认为是受损的收缩和放松患病心脏^1-4的主要机制。

在现实中，细胞内游离钙^离子 ，其功能如同在EC耦合 ​​账户信使约1％的总细胞内Ca ²⁺和广大^钙势必细胞内钙^离子缓冲^5,6。这是由于这样的事实，即各个^的 Ca ²⁺缓冲液是在心肌细胞丰富， 例如，膜磷脂，ATP，磷酸，钙调蛋白，小清蛋白，肌原纤维TNC，肌球蛋白，SERCA2a的，并且在对SR肌集钙蛋白^。5,6,7。其中，SERCA2a的和跨国公司是主要的^钙缓冲^5,6,7。此外，钙^离子结合到其缓冲器是抽搐期间一个动态的过程（ 例如，钙²⁺ 30-50％结合于肌钙蛋白和Ca期间将它解离²⁺瞬变^7）和中^的 Ca ²⁺结合的原因的其他变化在细胞内钙的改变游离钙^离子的"释放"到细胞质，结果²⁺浓度entration。因此，细胞内Ca ²⁺水平的扰动引起异常肌丝的运动，这是收缩功能障碍和心律失常^8,9的前体。许多因素（包括生理和病理）可以是肌丝蛋白质的转录后修饰，影响肌丝^的 Ca ²⁺缓冲和肌丝^的 Ca ²⁺敏感性^8-10的来源。最近，据报道，在肌丝蛋白突变增加^的 Ca ²⁺结合亲和力和细胞内Ca ²⁺的处理，触发^的 Ca ²⁺瞬变，异常^的 Ca ²⁺释放，和心律失常⁸的暂停依赖性增强。根据这一理念，我们也表现出高血压大鼠心脏继发于神经元型一氧化氮合酶上调的肌丝^钙脱敏与高架舒张和收缩^的 Ca ²⁺水平有关^11，这又增加了LTCC的对于Ca ²⁺依赖性失活¹²的脆弱性。因此，肌丝^的 Ca ²⁺敏感性是细胞内Ca ²⁺稳态和肌细胞收缩功能的"有效的"调节器。它已成为必要分析肌丝和Ca之间的相互作用²⁺处理的蛋白质为心肌兴奋收缩耦联及心功能的彻底调查。

在这里，我们描述了评估肌丝钙^离子敏感性在孤立的心肌细胞变化的协议。细胞内钙^离子分布的综合分析，肌丝钙^离子敏感性和收缩会发掘新机制基本心肌力学。

研究方案

该协议是按照指南卫生的联合国国家机构发布的实验室动物的护理和使用（NIH出版号85-23，1996年修订）。它是经首尔国立大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）（IACUC批准号:SNU-101213-1）。

1.缓冲液配制（表材料和设备）

1. 制备300毫升新鲜分离溶液对实验当天（以mM:氯化钠，135;氯化钾，5.4; MgCl ₂的，3.5;葡萄糖，5; HEPES，5; _的 Na ₂ HPO _4，0.4;牛磺酸，20; pH值7.4用NaOH）。
2. 制备100毫升新鲜的存储溶液在实验当天（以mM:NaCl的120;氯化钾5.4; MgSO ₄上5; _氯化钙 0.2;钠丙酮酸5;葡萄糖5.5;牛磺酸20; HEPES 10;甘露醇29; pH 7.4的用NaOH）。
3. 制备灌注溶液1L（以mM:氯化钠，141.4;氯化钾，4;和NaH ₂ PO _4，0.33; MGCL _2，1; HEPES，10;葡萄糖，5.5; _氯化钙 ，1.8;甘露醇，14.5; pH为7.4，用NaOH）。
4. 通过加入胶原酶（1毫克/毫升），蛋白酶（0.1毫克/毫升），牛血清白蛋白（BSA，1.67mg / ml）和钙^离子 （0.05毫摩尔）制备加入30ml胶原酶溶液1至25隔离毫升解。
5. 通过加入胶原酶（1毫克/毫升），牛血清白蛋白（1.67毫克/毫升），和钙^离子 （0.05毫摩尔）至16.7毫升隔离溶液制备20毫升胶原酶溶液2。
6. 通过加入0.4克的BSA至40ml的隔离溶液制备的40ml BSA溶液。单独10毫升和30ml成两个烧杯。添加^的 Ca ²⁺至30毫升BSA溶液，使最终的Ca ²⁺浓度的BSA溶液是1毫米。

2.准备左心室（LV）心肌细胞的隔离

1. 从动物设施的准备和隔离室转让清洁运输笼8-12周龄，雄性SD（SD）大鼠。
2. H吃两水浴至^37℃。
   注意:使用一种水浴水 - 夹套容器和的Langendorff灌注系统的灌注管。使用其他水浴以分离单个细胞搅动心肌组织的树干。
3. 加入5 ml和3.3的BSA溶液（不含Ca ^2+）至25毫升胶原酶溶液1和16.7 ml胶原酶溶液2 ml至补足体积至30ml和20ml，分别。
4. 在的Langendorff灌注系统，分别为（ 图1A）添加隔离溶液（100毫升）和胶原酶溶液1（30毫升）中，以第1列（第1栏）和第2列（第2列）。
5. 充氧在的Langendorff灌注系统（ 图1A） 通过氧连接管分离溶液和胶原酶溶液1中第1栏和Col.2。同样地，含氧化合物胶原酶溶液2，并在摇动的水槽用100％O ₂的经由所述BSA溶液氧气连接管。

3. LV心肌细胞的分离

1. 麻醉通过戊巴比妥钠（30毫克/千克）的腹膜内注射大鼠和脚趾捏和缺乏撤回反射的确认麻醉状态。
2. 移动老鼠解剖盘。在仰卧位，固定四条腿到主体用胶带的侧面。
3. 应用胸中期轴向切口手术剪刀打开胸腔，确保不损害心脏。使用另一一双干净的剪刀从血管连接（ 例如，上，下腔静脉，肺血管，主动脉）和心包膜¹³解剖心脏。
4. 留足够长的主动脉的一部分（5 - 8 mm产品），夹紧用细镊子主动脉，和1分钟（ 图1A）内快速安装的Langendorff灌注系统的插管。领带缝合线4/0紧紧过主动脉。
阀门打开上校1和10分钟预热和含氧隔离解决方案（灌注率:12-14毫升/分钟）灌注离体心脏。关闭阀上的第1栏，打开阀门上西2和8胶原酶溶液灌注1的心脏 - 10分钟。
5. 通过削减主动脉卸除消化心脏，并通过召开用钳子将主动脉含有新鲜的隔离解决方案（ 图1Bi）烧瓶中传送。用细剪刀和镊子大部分LV游离壁（包括隔膜），以切成小块（〜22毫米， 图1Bii）。
6. 转移片放入含预热和含氧的新鲜胶原酶溶液2（ 图1Biii）的烧瓶中。振摇10分钟。请提供氧气的含肌细胞胶原酶溶液2。
7. 移动心肌细胞-悬浮液10 ml离心管中，使用滴管带吸球，并添加^钙 -含BSA溶液（1:1的体积比）。离心在30克2分钟，弃上清。重悬在5ml BSA溶液的肌细胞沉淀。离心并弃去上清液。
8. 驱散心肌细胞颗粒，并在RT（ 图1Biv-VI）保持心肌细胞在10毫升预氧化的存储解决方案。
9. 在烧瓶内的剩余的LV组织 - 重复程序（3.9步骤3.7）。
   注意:不断重复的过程（步骤3.7 - 3.9）再次直到大部分LV组织消失，细胞获得了良好的收益。
10. 保持在存储溶液中的细胞在室温6-8小时，直至实验结束。

4.细胞内^钙瞬变和心肌细胞收缩的同时测量

1. 负载的LV心肌细胞与乙酰氧甲基酯的Fura-2 AM（2μM）。
   注:在黑暗的管（ 图1Bvii）装载的细胞执行所有加载的程序和实验。
   1. CENTRifuge在2000 xg离心肌细胞悬浮液（1ml）中，持续10秒。弃去上清液并重新悬浮于1ml台罗德氏溶液具有低Ca ²⁺浓度（250μM，表材料和设备）的肌细胞沉淀。
   2. 添加的Fura-2AM和泊洛沙姆407（2微升），轻轻分散肌细胞悬浮液，并保持该混合物在RT（20 - ^24℃）15分钟（ 图1Bvii）。
   3. 离心混合物，持续5秒，弃去上清液并分散肌细胞沉淀在1ml含有500μM ^的 Ca ²⁺灌注溶液。 10分钟后，离心该混合物，持续5秒，并丢弃上清液。
   4. 加入新鲜的灌注溶液（500μM ^钙 1毫升），并保持的Fura-2AM -加载 ​​心肌细胞颗粒在此解决方案的记录。
2. LV的细胞收缩和细胞内Ca ²⁺测定
   1. 录像之前，填补通过运行输液管与台氏溶液，这是水套预热到^36℃。
   2. 放置的Fura凌晨2点几滴 - 加载的LV心肌悬浮于5倒置荧光显微镜的腔室 - 8分钟。慢慢灌注台罗德氏溶液（2.2毫升/分钟）。
   3. 按数字刺激开始字段刺激（2赫兹）的前面板上的"启动"按钮。
      注意:输出电压（10V，5毫秒的持续时间）通过设置在腔室的任一侧铂导线施加到心肌细胞中的腔室。
      1. 选择细胞的合同稳定（而不是那些显示高血糖或低收缩）记录。
   4. 调整选择的心肌细胞中的基于视频的肌节检测系统的水平位置和调整显微镜的焦点，以获得肌节的最佳图像。在其中肌节清晰明确，直到平均观察到的区域紫色矩形框的位置肌节长度（红色峰）的显示单一尖峰（ 图2A，下图）。
   5. 记录响应于场刺激（ 图2A和B）小节的长度的变化。
      注意事项:1范围内使用加载的细胞 - 2小时。
   6. 调节摄像机的光圈，使得在基于视频的肌节的检测系统中的场是心肌细胞（ 图2A）的尺寸。刺激与360纳米/ 380纳米激发和发射510纳米（收购频率1000赫兹）的心肌细胞。记录肌节缩短和与场刺激（ 图2B）的Fura2调幅比。

5.肌丝钙^离子敏感性评价

1. 平均肌节长度和Ca在稳态²⁺瞬变（10 - 20痕量）和绘制的Fura-2比对相同的心肌细胞的肌节长度的相平面环（都与测量值S和增量变化; 图2C）。
2. 在每个小区，定义的Fura -2在50％松弛（EC _50， 图2C）的比例。比较这两个循环，每个干预的EC _50。

结果

LV肌细胞正常和高血压大鼠心脏分离。有明确的条纹（代表肌节），并稳定收缩响应于场刺激棒状细胞被认为是最佳的细胞和被选择用于记录（ 图2A）。在F中igure 2A所示的例子中，一个的Fura上午02点-loaded左心室心肌细胞水平定位并调节摄像机的光圈，使心肌细胞占据了大部分的记录区和最小的背景区域被包括在内。在录制现场，通过点击和拖动?...

讨论

这里，我们描述了协议，以评估肌丝^的 Ca ²⁺在单个孤立心肌细胞的敏感性的变化，并强调测定该参数一起电生理特性，细胞内Ca ²⁺瞬变，和肌丝动力学的重要性。这是因为一个或两个参数的记录可能没有阐明心脏收缩和舒张的基本机制。不同于测量肌细胞收缩和细胞内Ca ²⁺信息单独¹的常规方法，本方法检查这两个参数在相同的心肌细胞同时。 <...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM