Myofilament Ca Değerlendirilmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Duyarlılık temelinde Kardiyak Uyarma-kasılma Kaplin

Özet

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Özet

Kalp yetmezliği ve kardiyak aritmi, dünya çapında mortalite ve morbidite nedenlerinin başında gelmektedir. Ancak, hastalıklı kalbinde patogenezi ve miyokard arıza mekanizması tam açıklığa kavuşturulması kalır. Son zorlayıcı kanıtlar Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikler kardiyak miyositler hücre içi Ca ^{2 +} homeostazı ve iyon kanal faaliyetlerini etkileyen gösteriyor sağlıklı ve hastalıklı kalpleri kardiyak aksiyon potansiyeli ve daralma sorumlu temel mekanizmalar. Gerçekten de, (örneğin, Na ^+, Ca ²⁺ ve K ⁺ kanalları ve Na ⁺ -Ca ²⁺ değiştirici) ve hücre içi Ca ^{2 +} taşıma proteinleri (örneğin., Ryanodin reseptörleri ve Ca kardiyak aksiyon potansiyelleri altında yatan iyon kanallarının faaliyetleri ve taşıyıcılar sarkoplazmik retikulum (SERCA2a) ya da fosfolamban'ın ve fosforilasyon) ^{2 +} ATPaz geleneksel katı değerlendirme için ölçülürKalp eksitasyon-kasılma (EC) bağlantının temel mekanizmaları yedik. Myofilament kasılma ve gevşeme fonksiyonel birimi ve Myofilament Ca ^{2 +} duyarlılığı myofibril performans uygulanmasında zorunlu ise zarı ve hücre içi Ca ^{+ 2} değişiklikler iki elektriksel aktivitesindeki AT kuplaj başlatma sinyalleridir. Bu çalışmanın odak noktası olmadıkça Bununla birlikte, az sayıda çalışma miyokardın fonksiyonel analiz içine Myofilament Ca ²⁺ duyarlılığını içermektedir. Burada, sarkomer kısalma / yeniden uzaması ve Fura-2 AM (oranlı metrik algılama) ve sıçan kalpleri kardiyak miyozitlerde Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek kullanarak hücre içi Ca ^{2 +} seviyesini ölçen bir protokol açıklar. Temel amacı Ca ²⁺ duyarlılık mekanik analiz için AK bağlantı dikkate alınması gerektiğini Myofilament vurgulamaktır. i kapsamlı bir soruşturmaöteleme ve terapötik değeri daha etkili stratejiler tasarlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır sağlıklı ve hastalıklı kalplerde miyosit kontraktilite altında yatan kanalları, iyon taşıyıcılar, hücre içi Ca ^{2 +} taşıma ve Myofilament Ca ²⁺ hassasiyeti üzerinde.

Giriş

Kardiyak eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı miyokard, yani kalbin ^1,2 kasılma fonksiyonu mekanik özelliklerini analiz etmek için temel düzenidir. AK bağlantı sarkolemmal iyon kanallarının faaliyetleri ikincil membran depolarizasyon tarafından başlatılan (örneğin, yama-kelepçe teknikleri ile ölçülebilir voltaj kapılı Na ⁺ kanal). (Nanomolar gelen nM sitozolik Ca ^{2 +} konsantrasyonunun artması ryanodin reseptörleri (RyRs) aracılığıyla voltaj bağımlı L-tipi sonraki aktivasyonu Ca ^{2 +} kanal LTCCs aracılığıyla ²⁺ akını Ca toplu tetikler (LTCCs) ve Ca ²⁺ açıklaması, ) (uM) seviyesini mikromolar. Sitosolik Ca2 ⁺ böyle bir artış, ince filamanların troponin C (TNC) bağlanabilen ^{Ca2 +} teşvik eder ve ortaya çıkarır filament kompleks yapı değişiklikleri, aktin-miyosin etkileşimin kolaylaştırmak ve myocardi ulaşıral ³ daralma. Tersine, sitozolik Ca ^{2 +} SR Ca ^{2 +} -ATPase'ın ile sarkoplazmik retikulum (SR) (SERCA2a) geri re-Alınan veya Na ⁺ / Ca ²⁺ eşanjör ve plazmalemmal yoluyla miyosit dışarı ekstrüde edilir Ca ^{+ 2} ATPaz ^1,2. Sonuç olarak, sitozolik Ca düşüş ²⁺ aktin-miyozin ve miyosit rahatlama ^1-3 ayrışmasından kaynaklanan özgün durumuna ince filamentler yapısal değişiklikleri başlatır. Çoğu memeli kalp hücrelerinin ¹ sitosolik Ca2 ⁺ kaldırılması% 90 - Bu şemada, SERCA2a aktivitesi, genel olarak 70 oluşturmaktadır miyokardiyal gevşeme hızını belirlemek için kabul edilir. Vb LTCC, RYR ve SERCA2a, böyle anormal Ca ^{2 +} işleme gibi hastalıklı kalp ^1-4 bozulmuş kontraktilite ve dinlenmek için birincil mekanizma olarak kabul edilmiştir.

Gerçekte, ²⁺ toplam hücre içi Ca yaklaşık% 1 EC bağlantı hesaplarında haberci ve Ca ²⁺ çoğunluğu olarak işlev hücre içi Ca ^{2 +} tamponlar ^5,6 bağlıdır serbest sitozolik Ca ^{2 +.} Bu durum, çeşitli Ca ^{2 +} tamponlar, SR, örneğin, membran fosfolipidleri, ATP, fosfokreatin, kalmodulin, parvalbumin, myofibril TNC miyosin, SERCA2a ve calsequestrin kardiyak miyositlerde bol olduğu gerçeğidir. ^5,6,7. Aralarında, SERCA2a ve TNC baskın Ca2 ⁺ tamponlar ^5,6,7 vardır. Ayrıca, Ca ^{2 +} onun tamponlar bağlanmasını seğirme sırasında dinamik bir süreçtir ve ek nedeni bağlayıcı Ca değişikliği ²⁺ (örneğin, ²⁺ Ca% 30-50 ²⁺ transientler ⁷ TNC bağlanır ve Ca sırasında ondan ayırmak) kons ²⁺ hücre içi Ca değişiklikler de, sitoplazmada serbest Ca ^{2 +} sonuçlarını "serbest"entration. Sonuç olarak, hücre içi Ca ^{2 +} düzeyinin pertürbasyon kasılma disfonksiyonu ve aritmi ^8,9 öncüleri olan anormal Myofilament hareketleri, neden olur. (Fizyolojik ve patolojik hem de) pek çok faktör Myofilament Ca ^{2 +} tamponlama ve Myofilament Ca ²⁺ duyarlılığını ^8-10 etkileyen Myofilament proteinlerin post-transkripsiyonel modifikasyonları, kaynakları olabilir. Son zamanlarda, bu Ca ^{2 +} transientler, anormal Ca ^{2 +} bırakma ve aritmiler ⁸ duraklamaya bağlı güçlendirilmesini tetikleme, Myofilament proteinleri mutasyonlar Ca ^{2 +} bağlayıcı afinite ve hücre içi Ca2 ⁺ taşıma artış olduğu bildirilmiştir. Bu anlayış doğrultusunda, biz de yüksek sistolik ve diyastolik Ca ^{2 +} düzeyleri ile ilişkili nöronal nitrik oksit sentaz up-regülasyonu sekonder hipertansif sıçan kalplerinde o Myofilament Ca ^{2 +} duyarsızlaştırma göstermiştirSırayla, Ca ^{2 +} bağımlı inaktivasyon ¹² LTCC açığı artırmaktadır ^11. Bu nedenle, Myofilament Ca ²⁺ duyarlılığı hücre içi Ca2 ⁺ homeostasis ve miyosit kasılma fonksiyonu bir "aktif" düzenleyicisidir. Bu Myofilament ve Ca arasındaki etkileşimleri analiz etmek için gerekli hale gelmiştir ²⁺ miyosit AK kavraması ve kalp fonksiyonlarının ayrıntılı bir araştırma için proteinleri ele.

Burada, izole kardiyak miyositlerdeki Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikleri değerlendiren bir protokol açıklar. Hücre içi Ca ^{2 +} profilinin kapsamlı bir analiz, Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık ve daralma yeni mekanizmaları altında yatan miyokard mekaniği ortaya çıkarmak olacaktır.

Protokol

protokol Sağlık BM Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uygundur (NIH Yayın No. 85-23, 1996 revize). Bu Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (IACUC onayı No .: SNU-101213-1) tarafından onaylanmıştır.

1. Tampon Hazırlama (Tablo Malzemeleri ve Ekipmanları)

1. MM (deney gününde taze yalıtım çözeltisi 300 ml hazırlayın: NaCl, 135; KCI, 5.4; _MgCl2, 3.5; glukoz, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0.4, taurin, 20; pH 7.4 NaOH ile birlikte).
2. MM (deney gününde taze bir depolama solüsyonu 100 ml hazırlayın: NaCI 120; KCI 5,4; MgSO ₄ 5'tir; _CaCl2 0.2; sodyum piruvat 5'tir; 5.5 glikoz, taurin 20, HEPES 10, manitol 29, pH 7.4 ) NaOH ile.
3. MM perfüzyon çözeltisi 1L (hazırlayın: NaCl, 141.4; KCI, 4; NaH ₂ PO _4, 0.33; MGC_L2, 1 'dir; HEPES, 10; glukoz, 5.5; _CaCl2, 1.8; manitol, 14.5; NaOH ile pH 7.4).
4. Izolasyon 25 ml kollajenaz (1 mg / ml), proteaz (0.1 mg / ml), sığır serum albümini (BSA, 1.67mg / ml) ve Ca ^{2 +} (0.05 mM) ilave edilerek kolajenaz çözeltisi 30 ml 1 Hazırlama çözüm.
5. Yalıtım çözeltisi 16.7 ml (1 mg / ml), BSA (1.67 mg / ml) ve Ca ^{+ 2} (0.05 mM) kolajenaz ekleyerek kolajenaz çözeltisi 2 20 ml hazırlayın.
6. yalıtım çözeltisi 40 ml BSA 0.4 g eklenerek BSA çözeltisi 40 ml hazırlayın. 10 ml ve iki bardak içine 30 ml ayrı. : Ca BSA çözeltisi ^{2 +} 30 ml ilave edilir, böylece BSA çözeltisi nihai Ca2 ⁺ konsantrasyon 1 mM'dir.

Sol Ventriküler (LV) miyositler İzolasyonunda 2. Hazırlık

1. hazırlanması ve izolasyon odasına hayvan tesis temiz ulaşım kafeslerde 8-12 haftalık, erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanları aktarın.
2. H37 ^o C iki su banyoları yemek
   Not: Su için bir su banyosu kullanın - ceketli rezervuar ve Langendorff perfüzyon sistemi perfüzyon tüpleri. Tek miyositleri ayırmak amacıyla miyokard doku gövdelerine kışkırtmak diğer su banyosu kullanın.
3. Sırasıyla, 30 ml ve 20 ml hacim yapmak için 5 ml ve kolajenaz çözeltisi 1 ve 16.7 ml kolagenaz çözeltisi 2 25 ml (yaklaşık olmayan ²⁺⁾ BSA çözeltisi 3.3 ml.
4. Langendorff perfüzyon sistemine sırasıyla (Şekil 1A) izolasyon çözeltisi (100 mi) ve sütun 1 (Col 1) ile sütun 2 kolajenaz çözeltisi 1 (30 mi) (Col 2) ekleyin.
5. Langendorff perfüzyon sistemine (Şekil 1A) oksijen birleştirme borusu yoluyla, Sütun 1 ve Col.2 yalıtım solüsyonu ve kolajenaz çözeltisi 1 oksijen. Benzer şekilde, oxygenate kollajenaz çözüm 2 ve üzeri% 100 O ₂ ile sallayarak su banyosunda BSA çözeltisiOksijen bağlantı borusu.

LV miyosit 3. İzolasyon

1. Pentobarbital sodyum (30 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile SD sıçan anestezisi ve kıstırma ayak ve çekme yansıma eksikliği anestezi durumunu teyit.
2. Bir diseksiyon tepsisine sıçan taşıyın. yatar pozisyonda, bant ile vücudun kenarlarına dört ayağı sabitleyin.
3. kalbi zarar vermemeye sağlanması, göğüs açmak için cerrahi makas ile göğüs orta eksenel kesiler uygulayın. Bağlantı gemiler (örneğin, üst ve alt vena kava, pulmoner damarları ve aort) ve perikardiyal zarından ¹³ den kalbi incelemek için temiz makas başka bir çift kullanın.
4. Yeterli uzunlukta aort bir kısmını bırakın (5-8 mm), ince forseps ile aort kelepçe ve hızla 1 dakika (Şekil 1A) içinde Langendorff perfüzyon sistemi kanül monte edin. aorta üzerinde sıkıca dikiş ipliği 4/0 kravat.
5. Sütun 1 vananın açma ve 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış ve oksijenli izolasyon solüsyonu (perfüzyon oranı: 12-14 ml / dak) ile izole kalbi serpmek. , Col 1 vanayı kapatınız Sütun 2 valfi açmak ve 8 kollajenaz çözüm 1 ile kalbi serpmek - 10 dk.
6. Aorta keserek sindirilmiş kalbi ayırın ve taze izolasyon solüsyonu (Şekil 1Bi) içeren balona forseps ile aort tutarak aktarın. Daha küçük parçalara (~ 22 mm, Şekil 1Bii) içine (septum dahil) LV serbest duvar en kesmek için ince makas ve forseps kullanın.
7. Önceden ısıtılmış ve oksijenli taze kolajenaz çözeltisi 2 (Şekil 1Biii) ihtiva eden bir şişe içine parçaları aktarın. 10 dakika süre ile çalkalanır. miyosit içeren kollajenaz çözüm 2 oksijen teslim tutun.
8. (BSA çözeltisi içeren - ²⁺ bir emme ampul ile damlatıcıları kullanarak 10 ml santrifüj tüpüne süspansiyon ve Ca ekleyin - miyosit TaşıHacim olarak 1: 1). 2 dakika süreyle 30 g Santrifüj ve süpernatant atın. BSA çözeltisi 5 ml miyosit pelet yeniden askıya. Santrifüj süpernatantı atmak ve.
9. Miyosit pelet dağılması ve oda sıcaklığında (Şekil 1Biv-VI) önceden oksijenli bir depolama solüsyonu 10 ml miyositleri tutun.
10. şişede kalan LV dokusu ile - prosedürleri (3.9 3.7 adımlar) tekrarlayın.
    LV dokusunun çoğu miyositler iyi bir verim elde etmek için kaybolana kadar tekrar - (3.9 3.7 adımlar) prosedürleri tekrarlayarak tutun: Not.
11. Deneylerin sonuna kadar oda sıcaklığında 6-8 saat süreyle depolama çözümü myositler tutun.

Hücre içi Ca ² Geçici ve miyosit daralma 4. Eşzamanlı Ölçümleri

1. asetoksimetilester Fura-2 AM (2 mcM) ile yük LV miyositler.
   Not: Karanlık bir tüp (Şekil 1Bvii) yüklenen miyositler tüm yükleme prosedürleri ve deney gerçekleştirin.
   1. centr10 saniye boyunca 2000 x g'de miyosit süspansiyonu (1 mi) ifuge. Süpernatantı atın ve düşük Ca ^{2 +} konsantrasyonu (250 uM, Masa Malzemeleri ve Ekipmanları) ile Tyrode çözeltisi 1 ml miyosit pelet yeniden askıya.
   2. Yavaşça miyosit süspansiyon, dispers, Fura-2AM ve poloksamer 407 (2 ul) ekleyin ve oda sıcaklığında karışımın tutulması - 15 dakika boyunca (20 ila 24 ^° C) (Şekil 1Bvii).
   3. Santrifüj Karışım 5 saniye için, yüzer tabaka atılır ve 500 uM Ca2 ⁺ içeren perfüzyon çözeltisi 1 ml miyosit pelet dağılır. 10 dakika sonra, 5 saniye için karışım santrifüj ve supernatant atın.
   4. Taze perfüzyon çözeltisi (500 uM Ca2 ^+, 1 mi) ilave edilir ve, Fura-2AM tutulması - kayıtları için bu çözeltiye yüklenen miyosit pelet.
2. LV miyosit kasılması ve hücre içi Ca ölçümü ^{2 +}
   1. kaydetmeden önce, bir geçiyor perfüzyon tüpü doldurmakbir Tyrode çözeltisi ile su gömleği 36 ^o C önceden ısıtılmış
   2. 8 dakika - 5 için ters bir floresan mikroskop odasının yüklenen LV miyosit süspansiyon - Bir Fura 2 AM birkaç damla koyun. Yavaş yavaş Tyrode çözeltisi (2.2 mL / dakika) serpmek.
   3. alan stimülasyonu (2 Hz) başlatmak için dijital stimülatörü ön panelinde bulunan "start" düğmesine basın.
      Not: çıkış gerilimini (10 V, 5 msn süre) bölmenin her iki yanında yer alan platin teller üzerinden bölme miyosit uygulanır.
      1. stabil olduğu sözleşme Seç miyositler kayıt (hiper veya hipo-daralma göstererek olmayanlar).
   4. video tabanlı sarkomer algılama sisteminin yatay pozisyonda seçim miyosit ayarlayın ve sarkomer optimum görüntü elde etmek için mikroskop odağı ayarlayın. net sarkomer açıkça ortalamanın kadar gözlenir hangi alanda mor dikdörtgen kutu yerleştirinsarkomer uzunlukları (kırmızı tepe) bir tekil sivri bir tepe (Şekil 2A, alt resim) gösterir.
   5. Alan stimülasyonu (Şekil 2A ve B) cevaben sarkomer uzunluğunun değişiklikleri kaydedin.
      Not: 1 içinde yüklü miyositleri kullanın - 2 saat.
   6. Video tabanlı sarkomer algılama sistemine alan miyosit (Şekil 2A) boyutu böylece kameranın diyafram ayarlayın. 510 nm (satın alma frekansı 1000 Hz) 360 nm / 380 nm eksitasyon ve emisyon ile miyosit uyarır. Tutanak sarkomer kısalma ve alan uyarımı (Şekil 2B) ile Fura2 AM oranı.

Myofilament Ca ²⁺ Hassasiyet 5. Değerlendirme

1. Ölçülen değer ile hem (- (20 izleri 10) ve aynı miyosit ve sarkomer uzunluğu vs Fura-2 oranı faz-düzlem döngü arsa sarkomer uzunlukları ve kararlı durumda ^{2 +} transientler Ca ortalamas ve delta değişiklikleri; Şekil 2C).
2. Her arsa,% 50 rahatlama de Fura -2 oranı (EC _50, Şekil 2C) tanımlar. Döngü ve her müdahale EC ₅₀ hem karşılaştırın.

Sonuçlar

LV miyositler normal ve hipertansif sıçan kalpleri izole edilmiştir. Alan uyarılmasına tepki olarak açık bir şeritlerin (sarkomer temsil eder) ve sabit kasılmalarla çubuk şekilli miyositler uygun miyositler olarak kabul edilir ve kayıt (Şekil 2A) için seçilir. F ŞEKIL 2A'da gösterilen örnekte, Fura 02:00 AG miyosit yatay konumlandırılmış ve miyosit kayıt alanı ve en az arka bölgenin en dahildir kaplayacak şekilde kameranın ...

Tartışmalar

Burada, tek izole kardiyak miyosit içinde Myofilament Ca ²⁺ duyarlılık değişiklikleri değerlendirmek için protokoller tanımlar ve bu elektrofizyolojik özellikleri yanında parametreyi, hücre içi Ca ^{2 +} transientler ve Myofilament dinamiklerini ölçmek önemini vurgulamaktadır. bir ya da parametrelerin iki kayıtları kalp kasılma ve gevşeme altında yatan mekanizmaları izah olmayabilir olmasıdır. Miyosit daralma ve hücre içi Ca2 ⁺ profil ayrı ayrı ¹ ölç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM