Beurteilung der myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung

Zusammenfassung

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Zusammenfassung

Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca ²⁺ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na ^+, Ca ²⁺ und K ⁺ -Kanäle und der Na ⁺ -Ca ²⁺ Exchanger) und die intrazelluläre Ca ²⁺ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca ²⁺ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca ²⁺ Veränderungen sind die Triggersignale von EC - Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca ²⁺ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca ²⁺ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca ²⁺ Handhabung und myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.

Einleitung

Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens ^1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na ⁺ Kanal, der durch Patch-Clamp - Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ - Ca ²⁺ -Kanälen (LTCC) und Ca ²⁺ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca ²⁺ -Freisetzung durch Ryanodin - Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca ²⁺ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca ²⁺ Ca ²⁺ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin - Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion ^3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca ²⁺ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca ²⁺ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na ⁺ / Ca ²⁺ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca ²⁺ ATPase ^1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca ²⁺ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung ^1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 - Konten - 90% der cytosolischen Ca ²⁺ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen ^1. Als solche anormalen Handhabung Ca ²⁺ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz ^1-4 betrachtet.

In Wirklichkeit frei cytosolischen Ca ²⁺ , die Funktionen als der Bote in der EG - Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca ²⁺ und die Mehrheit der Ca ²⁺ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 ⁺ Puffer ^5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca ²⁺ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran - Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. ^5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 ⁺ Puffer ^5,6,7. Weiterhin ²⁺ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca ²⁺ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca ²⁺ Transienten ⁷⁾ und die Änderung in Ca ²⁺ Bindungs ​​Ursache zusätzlicher "Freigabe" von freiem Ca ²⁺ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca ²⁺ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca ²⁺ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien ^8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine ​​sein, die myofilament Ca ²⁺ Pufferung und myofilament ^{2+ 8-10} Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine ​​, die die Ca ²⁺ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 ⁺ Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca ²⁺ Transienten, abnormal Ca ²⁺ Freisetzung und Arrhythmien ^8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca ²⁺ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca ²⁺ Ebenen zugeordnet gezeigt^11, die wiederum ¹² die Anfälligkeit der LTCC auf Ca ²⁺ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit ein "aktives" Regulator der intrazellulären Ca ²⁺ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca ²⁺ zu analysieren Proteine ​​für die gründliche Untersuchung von myocyte EG - Kopplung und die Herzfunktion Handhabung.

Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca ²⁺ Profil, myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.

Protokoll

Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die UN-National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996). Es wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Seoul National University (IACUC Zulassung Nr .: SNU-101213-1) zugelassen.

1. Puffer Vorbereitung (Tabelle Materialien und Geräte)

1. Bereiten 300 ml frisches Isolationslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl ₂ 3,5; Glucose, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; Taurin, 20; pH 7,4 mit NaOH).
2. Herstellung von 100 ml frischem Aufbewahrungslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0,2; Natrium-Pyruvat 5; 5,5 Glucose; Taurin 20; HEPES 10; Mannit 29; pH 7,4 mit NaOH).
3. Bereiten 1L Perfusionslösung (in mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MgCl _2, 1; HEPES, 10; Glucose, 5,5; CaCl _2, 1,8; Mannit, 14.5; pH 7,4 mit NaOH).
4. Herstellung von 30 ml Kollagenase - Lösung 1 durch Kollagenase - Zugabe (1 mg / ml), Protease (0,1 mg / ml), Rinderserumalbumin (BSA, 1.67mg / ml) und Ca ²⁺ (0,05 mM) 25 ml Isolations Lösung.
5. Es werden 20 ml Kollagenase - Lösung 2 durch Kollagenase Zugabe (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) und Ca ²⁺ (0,05 mM) zu 16,7 ml Isolierungslösung.
6. Vorbereitung 40 ml BSA-Lösung durch Zugabe von 0,4 g BSA zu 40 ml Isolationslösung. Separate 10 ml und 30 ml in zwei Bechern. Hinzufügen Ca ²⁺ zu 30 ml BSA - Lösung so , dass die endgültige Ca ²⁺ -Konzentration in der BSA - Lösung beträgt 1 mM.

2. Vorbereitung für die Isolierung der linksventrikulären (LV) Myozyten

1. Übertragen 8-12 Wochen alte, männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten in sauberen Transportkäfigen aus dem Tier Anlage zur Herstellung und Isolierung Raum.
2. Hessen zwei Wasserbäder bis 37 ^o C.
   Hinweis: Verwenden Sie ein Wasserbad für das Wasser - ummantelten Reservoir und den Perfusionsschläuche des Langendorff-Perfusionssystem. Verwenden Sie die anderen Wasserbad Myokardgewebe Stämme, um zu agitieren einzelnen Myozyten zu trennen.
3. 5 ml und 3,3 ml BSA - Lösung (ohne Ca ²⁺⁾ zu 25 ml Kollagenase - Lösung 1 und 16,7 ml Kollagenase - Lösung 2 , um das Volumen auf 30 ml zu begrenzen und 20 ml.
4. Hinzufügen Isolationslösung (100 ml) und Kollagenase - Lösung 1 (30 ml) zu Spalte 1 (Col. 1) und der Spalte 2 (Col. 2) in der Langendorff - Perfusionssystem, bzw. (1A).
5. Oxydieren das Isolationslösung und Kollagenase - Lösung 1 in Spalte 1 und Spalte 2 über das Sauerstoffverbindungsrohr in der Langendorff - Perfusionssystem (1A). In ähnlicher Weise oxygenate Kollagenase - Lösung 2 und die BSA - Lösung im Schüttelwasserbad mit 100% O ₂ über dieSauerstoff Verbindungsrohr.

3. Isolierung von LV Myozyten

1. Anesthetize eine SD - Ratte über intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (30 mg / kg) und das Anästhetikum Status durch Zeh bestätigen Kneifen und der Mangel an Rückzug Reflexion.
2. Bewegen Sie die Ratte auf eine Dissektion Fach. In der Rückenlage, sichern Sie die vier Beine an den Seiten des Körpers mit Klebeband.
3. Bewerben Brust-Mitte axiale Einschnitte mit chirurgischen Schere, um die Truhe zu öffnen, um sicherzustellen, das Herz nicht zu beschädigen. Verwenden Sie ein anderes Paar saubere Schere , um das Herz von den Verbindungsgefäße zu sezieren (zB obere und untere Hohlvene, Lungengefäße und Aorta) und Perikardmembran ^13.
4. Lassen Sie einen Teil der Aorta eine ausreichende Länge (5-8 mm), klemmen die Aorta mit einer feinen Pinzette, und montieren Sie schnell die Kanüle des Langendorff - Perfusionssystem innerhalb von 1 min (1A). Binden Sie Nähfaden 4/0 dicht über der Aorta.
5. Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1 und das isolierte Herz mit vorgewärmten und mit Sauerstoff angereicherten Isolationslösung für 10 min (Perfusions-Rate: 12-14 ml / min) perfuse. Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1, schalten Sie das Ventil auf Spalte 2 und perfuse das Herz mit Kollagenase-Lösung 1 für 8 - 10 min.
6. Abmontieren verdaut Herz durch die Aorta schneiden und übertragen es durch Halten der Aorta mit einer Pinzette in den Kolben mit frischen Isolationslösung (Abbildung 1Bi). Verwenden einer feinen Schere und Pinzette die meisten der LV freien Wand zu schneiden (einschließlich des Septum) in kleinere Stücke (~ 22 mm, Abbildung 1Bii).
7. Übertragen Sie die Stücke in einen Kolben vorgewärmte und mit Sauerstoff angereicherte frische Kollagenase - Lösung 2 (Abbildung 1Biii) enthält. Schütteln für 10 min. Halten Sie sich an die myocyte haltigen Kollagenase-Lösung 2 liefert Sauerstoff.
8. Bewegen Sie den myocyte - Suspension auf eine 10 ml Zentrifugenröhrchen Tropfer mit einem Saugball mit und fügen Ca ²⁺ - enthält BSA - Lösung (1: 1 in Volumen). Zentrifuge bei 30 g für 2 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets Myozyten in 5 ml BSA-Lösung. Zentrifuge und den Überstand verwerfen.
9. Disperse die myocyte Pellets und halten Myozyten in 10 ml vorge mit Sauerstoff angereicherte Speicherlösung bei RT (Abbildung 1Biv-vi).
10. Wiederholen Sie die Verfahren (Schritte 3,7-3,9) mit dem restlichen LV Gewebe in den Kolben.
    Hinweis: Bewahren Sie die Verfahren zu wiederholen (Schritte 3,7 bis 3,9) erneut, bis die meisten der LV Gewebe verschwindet eine gute Ausbeute an Myozyten zu erhalten.
11. Halten Sie die Myozyten in Speicherlösung für 6-8 Stunden bei RT bis zum Ende der Experimente.

4. Gleichzeitige Messungen intrazellulärer Ca ²⁺ Transienten und Muskelzellen Kontraktions

1. Last LV Myozyten mit dem Acetoxymethylester Fura-2 AM (2 uM).
   Hinweis: Führen Sie alle Ladevorgänge und Experimente mit geladenen Myozyten in einem dunklen Rohr (Abbildung 1Bvii).
   1. Centrifuge die Myozyten-Suspension (1 ml) bei 2.000 xg für 10 sec. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren die myocyte Pellet in 1 ml Tyrode - Lösung mit einer niedrigen Ca ²⁺ Konzentration (250 & mgr; M, Tisch Materialien und Geräte).
   2. In Fura-02.00 und Poloxamer 407 (2 ul), sanft die myocyte Suspension zu dispergieren, und halten Sie die Mischung bei RT (20 bis 24 ^° C) für 15 Minuten (Abbildung 1Bvii).
   3. Zentrifuge die Mischung für 5 Sekunden, um den Überstand verwerfen und die Myozyten - Pellet in 1 ml Perfusionslösung ²⁺ , enthaltend 500 uM Ca dispergieren. Nach 10 min Zentrifugation der Mischung für 5 Sekunden und den Überstand verwerfen.
   4. In frischen Perfusions - Lösung (500 & mgr; M Ca ^2+, 1 ml) und halten Sie die Fura-02.00 - geladen myocyte Pellet in dieser Lösung für Aufnahmen.
2. Messung des LV Myozyten Kontraktion und intrazellulären Ca ²⁺
   1. Vor der Aufnahme, füllen Sie das Perfusions-Schlauch, der durch eine läuftWassermantel mit der Tyrode - Lösung, die auf 36 ^o C vorgewärmt ist
   2. Legen Sie ein paar Tropfen des Fura 02.00 - geladen LV myocyte Suspension auf die Kammer eines invertierten Fluoreszenzmikroskop 5 - 8 min. perfuse langsam die Tyrode-Lösung (2,2 ml / min).
   3. Drücken Sie die Schaltfläche "Start" auf der Frontplatte des digitalen Stimulator Feldstimulation (2 Hz) starten.
      Hinweis: Die Ausgangsspannung (10 V, 5 msec Dauer) wird in der Kammer durch Platindrähte mit den Myozyten aufgebracht auf jeder Seite der Kammer positioniert ist.
      1. Wählen Sie Myozyten stabil, dass Vertrag (nicht diejenigen, die Anzeige Hyper- oder Hypo-Kontraktion) für die Aufnahme.
   4. Stellen Sie die myocyte der Wahl in der horizontalen Position des videobasierten Sarkomers Detektionssystem und stellen Sie den Fokus des Mikroskops optimale Bilder von Sarkomere zu erhalten. Positionieren Sie den lila rechteckigen Kasten auf dem Gebiet, in dem klar Sarkomere klar, bis die durchschnittliche beobachtet werdenvon Sarkomers Längen (rot Peak) zeigt eine singuläre scharfe Spitze (2A, unteres Bild).
   5. Aufzeichnen der Änderungen der Sarkomerlänge in Reaktion auf Feldstimulation (2A und B).
      Hinweis: Verwenden Sie die geladenen Myozyten in 1 - 2 Stunden.
   6. Stellen Sie die Blende der Kamera so , dass das Feld in der videobasierten Sarkomers Detektionssystem ist die Größe der Myozyten (2A). Stimulieren die Myozyten mit einer Anregung bei 360 nm / 380 nm und Emission bei 510 nm (Erfassungsfrequenz 1000 Hz). Nehmen Sie Sarkomerverkürzung und die Fura2 AM Verhältnis mit Feldstimulation (2B).

5. Bewertung der myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit

1. Der Mittelwert der Sarkomers Längen und Ca ²⁺ Transienten im Steady-State (10 - 20 Spuren) , und zeichnen Sie die Phase-Ebene Schleife des Fura-2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge des gleichen myocyte (beide mit Messwerts und Deltaänderungen; 2C).
2. In jedem Plot definieren Fura -2 - Verhältnis bei 50% Relaxation (EC _50, 2C). Vergleichen Sie sowohl die Schleife und EC ₅₀ von jeder Intervention.

Ergebnisse

LV Myozyten werden aus normalen und hypertensiven Rattenherzen isoliert. Stabförmige Myozyten mit klaren Riefen (die Sarkomere) und stabile Kontraktionen in Reaktion auf Feldstimulation werden als die optimale Myozyten zu sein und sind für die Aufnahmen (2A) ausgewählt. In dem Beispiel in F ild 2A gezeigt ist , -beladene a Fura 02.00 LV Myozyten ist horizontal und die Blende der Kamera positioniert ist , so eingestellt, dass die Myozyten der größte ...

Diskussion

Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca ²⁺ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 ⁺ Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM