Évaluation des myofilaments Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilité sous-jacente cardiaque Excitation-contraction Couplage

Résumé

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Résumé

L'insuffisance cardiaque et des arythmies cardiaques sont les principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde entier. Cependant, le mécanisme de la pathogenèse et de dysfonctionnement du myocarde dans le cœur malade reste à être pleinement clarifié. Des preuves convaincantes récentes démontrent que les changements dans la sensibilité du myofilament Ca affectent Ca intracellulaire ²⁺ activités de l' homéostasie et canaux ioniques dans les myocytes cardiaques, les mécanismes essentiels responsables du potentiel d'action cardiaque et la contraction dans les cœurs sains et malades. En effet, les activités des canaux ioniques et des transporteurs sous - jacents potentiels d'action cardiaques (par exemple, Na ^+, Ca ²⁺ et K ⁺ et des canaux ²⁺ échangeur Na ⁺ -Ca) et le ^{Ca2 +} intracellulaire des protéines (par exemple , la manipulation., Les récepteurs de la ryanodine et Ca ^{2 +} -ATPase dans réticulum sarcoplasmique (SERCA2a) ou phospholambane et sa phosphorylation) sont classiquement mesurée Evalumangé les mécanismes fondamentaux de cardiaque excitation-contraction (CE) de couplage. Les deux activités électriques dans la membrane et les changements Ca2 ⁺ intracellulaires sont les signaux de déclenchement de couplage CE, alors que myofilament est l'unité fonctionnelle de contraction et de relaxation, et la sensibilité ^de myofilament Ca est impératif dans la mise en œuvre de la performance myofibrille. Néanmoins, peu d' études intègrent la sensibilité ^de myofilament Ca dans l'analyse fonctionnelle du myocarde sauf si elle est l'objet de l'étude. Ici, nous décrivons un protocole qui mesure sarcomère shortening / re-allongement et le intracellulaire niveau Ca ²⁺ en utilisant Fura-2 AM (de détection ratiométrique) et d' évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques de coeurs de rats. L'objectif principal est de souligner que la sensibilité myofilament Ca doit être pris en considération dans le couplage CE pour l' analyse mécaniste. enquête approfondie sur isur les canaux, les transporteurs d'ions Ca ²⁺ intracellulaire, la manipulation et la sensibilité ^de myofilament Ca qui sous - tendent myocytes contractilité dans les cœurs sains et malades fournira des informations précieuses pour la conception de stratégies plus efficaces de translation et de valeur thérapeutique.

Introduction

Excitation-contraction cardiaque (EC) de couplage est le schéma fondamental pour analyser les propriétés mécaniques du myocarde, à savoir la fonction contractile du cœur ^1,2. Couplage C'est initiée par dépolarisation de la membrane secondaire par rapport à l'activité des canaux ioniques sarcolemmiques (par exemple le canal Na ⁺ voltage-dépendants, qui peut être mesurée par des techniques de patch-clamp). L' activation subséquente de type L voltage-dépendants canaux ^{Ca2 +} (LTCCs) et influx de Ca ²⁺ par LTCCs déclencher la masse de Ca ²⁺ libération par le biais des récepteurs de la ryanodine (les RyRs), augmentant ainsi la cytosolique concentration en Ca ²⁺ du nanomolaire (nM ) micromolaire (uM) niveau. Une telle augmentation de Ca ²⁺ cytosolique favorise la liaison à ^{Ca2 +} troponine C (CTN) en filaments fins et induit des changements conformationnels du complexe du filament pour faciliter l'interaction actine-myosine et atteint myocardial contraction ^3. A l' inverse, le Ca ²⁺ cytosolique est re-uptaken retour dans le réticulum sarcoplasmique (SR) par le ^{Ca2 +} ATPase dans SR (SERCA2a) ou est extrudé hors de la myocytes via ²⁺ échangeur Na ⁺ / Ca et le plasmiques Ca ²⁺ ATPase ^1,2. Par conséquent, la baisse de Ca cytosolique ²⁺ incite des changements conformationnels de minces filaments à l'état d' origine, ce qui entraîne la dissociation de l' actine-myosine et myocytes relaxation ^1-3. Dans ce système, l'activité de SERCA2a est généralement considérée pour déterminer la vitesse de relaxation du myocarde , car elle représente 70-90% de ^{Ca2 +} cytosolique retrait dans la plupart des cellules cardiaques mammaliennes ^1. En tant que tel, anormale ^{Ca2 +} manipulation par LTCC, RyR et SERCA2a, etc. ont été considérés comme les principaux mécanismes de troubles de la contractilité et de détente au cœur malade ^1-4.

En réalité, libre cytosolique Ca ²⁺ qui fonctionne comme le messager dans les comptes de couplage CE pour environ 1% du total intracellulaire de ^{Ca2 +} et la majorité de Ca ²⁺ est lié à intracellulaires ^Ca2 tampons ^5,6. Ceci est dû au fait que les différents tampons de ^{Ca2 +} sont abondants dans les myocytes cardiaques, par exemple, des phospholipides membranaires, l' ATP, phosphocréatine, la calmoduline, la parvalbumine, myofibril TnC, la myosine, SERCA2a et calséquestrine dans le RP. ^5,6,7. Parmi eux, SERCA2a et TNC sont prédominants ^{Ca2 +} tampons ^5,6,7. En outre, Ca ²⁺ se liant à ses tampons est un processus dynamique au cours de contraction (par exemple, 30-50% de Ca ²⁺ se lie à TnC et désolidarisé pendant Ca ^{2 +} transitoires ⁷⁾ et le changement de Ca ²⁺ cause supplémentaire de liaison "libérer" de la libre Ca ²⁺ dans le cytosol, les résultats dans les altérations du ^{Ca2 *} intracellulaire concntration. Par conséquent, la perturbation du niveau intracellulaire de ^{Ca2 +} induit des mouvements anormaux myofilament, qui sont les précurseurs du dysfonctionnement contractile et l' arythmie ^8,9. De nombreux facteurs ( à la fois physiologiques et pathologiques) peuvent être des sources de modifications post-transcriptionnelles de protéines de myofilaments qui influencent la sensibilité ^de myofilaments tampon ^{Ca2 +} et Ca myofilaments ^8-10. Récemment, il a été rapporté que des mutations dans les protéines myofilament augmentent le Ca ²⁺ affinité de liaison et intracellulaire de ^{Ca2 +} manipulation, déclenchant une pause-dépendante potentialisation de Ca ^{2 +} transitoires, Ca ²⁺ libération anormale, et arythmies ^8. Conformément à ce concept, nous avons également montré que myofilament Ca ²⁺ désensibilisation dans les cœurs de rats hypertendus secondaires à la régulation positive de la synthase neuronale de l' oxyde nitrique est associée à diastolique élevée et systolique niveaux de ^{Ca2 +11,} qui , à son tour, augmente la vulnérabilité du LTCC à l' inactivation dépendante ^de Ca ^12. Par conséquent, la sensibilité ^de myofilament Ca est un régulateur "actif" de ^{Ca2 +} intracellulaire homéostasie et myocytes fonction contractile. Il est devenu nécessaire d'analyser les interactions entre myofilament et ^{Ca2 +} manipulation des protéines d' une enquête approfondie des myocytes couplage CE et la fonction cardiaque.

Ici, nous décrivons un protocole qui permet d' évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca dans les myocytes cardiaques isolés. Une analyse complète des ^{Ca2 +} intracellulaire profil, la sensibilité et la contraction ^de myofilament Ca va déterrer de nouveaux mécanismes mécanique du myocarde sous - jacents.

Protocole

Le protocole est en conformité avec le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire publiées par les Instituts nationaux de la santé des Nations Unies (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996). Elle a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université nationale de Séoul (approbation IACUC no .: SNU-101213-1).

1. Préparation du tampon (tableau matériel et équipement)

1. Préparer 300 ml de solution d'isolation fraîches le jour de l'expérience (en mM: NaCl 135; KCl, 5,4; _MgCl2, 3,5; glucose 5; HEPES, 5, Na ₂ HPO _4, 0,4, taurine, 20; pH 7,4 avec du NaOH).
2. Préparer 100 ml d' une solution de stockage fraîches le jour de l'expérience (en mM: NaCl 120; KCl 5,4; _MgSO4 5; CaCl ₂ 0,2; sodium pyruvate 5; glucose 5,5; taurine 20; HEPES 10, mannitol 29; pH 7,4 avec NaOH).
3. Préparer 1L de solution de perfusion (en mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MgCL _2, 1; HEPES, 10; glucose, 5,5; CaCl _2, 1,8; le mannitol, 14,5; pH 7,4 avec NaOH).
4. Préparer 30 ml de solution de collagénase 1 par addition de collagénase (1 mg / ml), de la protéase (0,1 mg / ml), de l' albumine de sérum bovin (BSA, 1.67mg / ml), et le ^{Ca2 +} (0,05 mM) à 25 ml d'isolement Solution.
5. Préparer 20 ml de solution de collagénase 2 par addition de collagénase (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), et le ^{Ca2 +} (0,05 mM) à 16,7 ml de solution d'isolation.
6. Préparer 40 ml de solution de BSA par addition de 0,4 g de SAB à 40 ml de solution d'isolation. Séparée 10 ml et 30 ml dans deux béchers. Ajouter ^{Ca2 +} à 30 ml de solution de SAB de sorte que la concentration finale en ^{Ca2 +} dans la solution de BSA est de 1 mM.

2. Préparation pour l'isolement du ventricule gauche (LV) myocytes

1. Transfert 8-12 semaine-vieux, Sprague-Dawley (SD) des rats dans des cages de transport propres de l'installation de l'animal à la salle de préparation et d'isolement.
2. Hmanger deux bains d'eau à 37 ^o C.
   Remarque: Utilisez le bain d'une eau pour l'eau - réservoir chemisé et les tubes de perfusion du système de perfusion Langendorff. Utilisez l'autre bain d'eau pour agiter les troncs de tissus myocardiques afin de séparer les myocytes simples.
3. Ajouter 5 ml et 3,3 ml de solution de BSA (sans ^{Ca2 +)} à 25 ml d' une solution de collagénase 1 et 16,7 ml d'une solution de collagénase 2 pour compenser le volume à 30 ml et 20 ml, respectivement.
4. Ajouter la solution d'isolation (100 ml) et une solution de collagénase 1 (30 ml) à la colonne 1 (colonne 1) et la colonne 2 (colonne 2) dans le système Langendorff de perfusion, respectivement (figure 1A).
5. Oxygéner la solution d'isolation et d'une solution de collagénase 1 dans la colonne 1 et Col.2 via le tube de raccordement d'oxygène dans le système de perfusion de Langendorff (figure 1A). De même, une solution de collagénase oxygénat 2 et la solution de BSA dans le bain-marie à agitation avec 100% d' O ₂ par l'intermédiaire dutube de raccordement d'oxygène.

3. Isolement de myocytes LV

1. Anesthetize un rat SD par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (30 mg / kg) et de confirmer l'état d' anesthésie par orteil pincement et l' absence de retrait réflexion.
2. Déplacer le rat sur un plateau de dissection. En position couchée, fixer les quatre pattes sur les côtés du corps avec du ruban adhésif.
3. Appliquer thoracique incisions mi-axiales avec des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le coffre, en veillant à ne pas endommager le cœur. Utilisez une autre paire de ciseaux propres à disséquer le cœur des vaisseaux de connexion (par exemple, cava supérieur et inférieur vena, vaisseaux pulmonaires, et de l' aorte) et de la membrane péricardique ^13.
4. Laisser une partie de l'aorte , d'une longueur suffisante (5-8 mm), serrer l'aorte avec une pince fine, et de monter rapidement la canule du système de perfusion de Langendorff à moins de 1 min (figure 1A). Attachez fil de suture 4/0 étroitement sur l'aorte.
5. Ouvrir le robinet sur la colonne 1 et perfuser le coeur isolé avec une solution pré-chauffée et oxygénée isolement pendant 10 min (débit de perfusion: 12-14 ml / min). Fermez le robinet sur la colonne 1, mettez la valve sur Col. 2 et perfuser le cœur avec une solution de collagénase 1 pendant 8 - 10 min.
6. Démonter le coeur digéré en coupant l'aorte et le transférer en maintenant l'aorte avec une pince dans le flacon contenant une solution d'isolation frais (Figure 1BI). Utilisez des ciseaux fins et des pinces pour couper la majeure partie de la paroi libre LV (y compris le septum) en petits morceaux (~ 22 mm, Figure 1Bii).
7. Transférer les morceaux dans un flacon contenant une solution préchauffée et oxygénée collagénase frais 2 (Figure 1Biii). Agiter pendant 10 min. Fournir de l'oxygène à maintenir la solution contenant la collagénase-2 myocytes.
8. Déplacez le myocytes - suspension à un tube de 10 ml de centrifugeuse en utilisant pipettes avec une ampoule d'aspiration et ajouter Ca ²⁺ - contenant une solution BSA (1: 1 en volume). Centrifuger à 30 g pendant 2 minutes et jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot de myocytes dans 5 ml de solution de BSA. Centrifugeuse et jeter le surnageant.
9. Disperser les pastilles de myocytes et de garder les myocytes dans 10 ml de solution de pré-oxygénée stockage à température ambiante (figure 1Biv-vi).
10. Répéter les opérations (étapes 3/7 à 3/9) avec le tissu LV restant dans le ballon.
    Remarque: Continuez à répéter les procédures (étapes 03.07 à 03.09) jusqu'à ce que la plupart des tissus LV disparaît pour obtenir un bon rendement de myocytes.
11. Maintenir les myocytes dans une solution de stockage pendant 8/6 heure à température ambiante jusqu'à la fin des expériences.

4. Les mesures simultanées de intracellulaires Ca ²⁺ Transitoires et myocytes Contraction

1. myocytes charge BT avec l'ester acétoxyméthyle Fura-2 AM (2 uM).
   Remarque: Effectuez toutes les procédures et expériences chargement avec myocytes chargés dans un tube noir (Figure 1Bvii).
   1. Centrifuge la suspension de myocytes (1 ml) à 2 000 x g pendant 10 s. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de myocytes dans 1 ml de solution de Tyrode avec une faible concentration de Ca ²⁺ (250 uM, Tableau matériel et équipement).
   2. Ajouter Fura-2 heures et poloxamère 407 (2 pi), disperser doucement la suspension de myocytes, et maintenir le mélange à la température ambiante (20-24 ^° C) pendant 15 minutes (Figure 1Bvii).
   3. Centrifuger le mélange pendant 5 secondes, éliminer le surnageant et on disperse le culot de myocytes dans 1 ml de solution de perfusion contenant 500 uM de Ca ^2+. Au bout de 10 min, centrifuger le mélange pendant 5 sec et jeter le surnageant.
   4. Ajouter une solution de perfusion frais (500 uM Ca ^2+, 1 ml) et de garder le Fura-2 heures - culot myocytes chargé dans cette solution pour les enregistrements.
2. Mesure de LV myocytes contraction et intracellulaire de ^{Ca2 +}
   1. Avant d'enregistrer, remplir le tube de perfusion qui fonctionne à travers unchemise d'eau avec la solution de Tyrode, qui est pré-chauffé à 36 ^° C
   2. Placez quelques gouttes de la Fura 2 heures - chargé LV myocytes suspension sur la chambre d'un microscope inversé à fluorescence pour 5-8 min. perfuser lentement la solution de Tyrode (2,2 ml / min).
   3. Appuyez sur le bouton "start" sur le panneau avant du stimulateur numérique pour commencer la stimulation de champ (2 Hz).
      Remarque: La tension de sortie (V 10, 5 msec durée) est appliquée aux myocytes dans la chambre par des fils de platine positionnés de part et d'autre de la chambre.
      1. qui se contractent de manière stable Sélectionnez myocytes (pas ceux affichant hyper- ou hypo-contraction) pour l'enregistrement.
   4. Réglez le myocytes de choix dans la position horizontale du système de détection sarcomère basé sur la vidéo et ajuster la mise au point du microscope pour obtenir des images optimales de sarcomères. Placez la boîte rectangulaire pourpre sur la zone dans laquelle sarcomères claires sont clairement observés jusqu'à ce que la moyennedes longueurs de sarcomères (pic rouge) affiche un pic singulier forte (figure 2A, image inférieure).
   5. Notez les changements de longueur de sarcomère en réponse à une stimulation de champ (Figure 2A et B).
      Remarque: Utilisez les myocytes chargés dans les 1 - 2 h.
   6. Régler l'ouverture de la caméra de sorte que le champ dans le système de détection de sarcomères vidéo basée sur la taille de myocyte (figure 2A). Stimule la myocytes avec une excitation à 360 nm / 380 nm et émission à 510 nm (fréquence d'acquisition de 1000 Hz). Enregistrez le raccourcissement des sarcomères et le rapport Fura2 AM avec une stimulation de champ (figure 2B).

5. L' évaluation de la sensibilité ^de myofilament Ca

1. La moyenne des longueurs de sarcomères et Ca ^{2 +} transitoires à l' état ​​d' équilibre (10 - 20 traces) et tracer la boucle à phase plan du rapport Fura-2 par rapport à la longueur des sarcomères du même myocytes ( à la fois avec la valeur mesurées et delta changements; Figure 2C).
2. Dans chaque parcelle, définir Fura de ratio à 50% de relaxation (CE _50, figure 2C). Comparer à la fois la boucle et CE ₅₀ de chaque intervention.

Résultats

myocytes LV sont isolés des coeurs de rats normaux et hypertendus. Myocytes en forme de tige avec des stries claires (représentant sarcomères) et des contractions stables en réponse à une stimulation de champ sont considérés comme les myocytes optimales et sont sélectionnés pour les enregistrements (figure 2A). Dans l'exemple représenté en F igure 2A, une Fura 2 heures LV myocytes est chargé en position horizontale et l'ouverture de l...

Discussion

Ici, nous décrivons les protocoles pour évaluer les changements de la sensibilité ^de myofilament Ca en simple myocytes cardiaques isolés et soulignons l'importance de mesurer ce paramètre aux côtés de propriétés électrophysiologiques, intracellulaires Ca ^{2 +} transitoires, et la dynamique des myofilaments. En effet, les enregistrements d'une ou deux des paramètres ne peuvent pas expliquer les mécanismes sous-tendant la contraction cardiaque et la relaxation. A la différence des ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM