筋フィラメントのCaの評価<sup&gt; 2+</sup&gt;感度基礎心臓興奮収縮連関

要約

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

要約

心不全や不整脈は、世界中の死亡率および罹患率の主要な原因です。しかし、疾患のある心臓における病因および心筋機能不全のメカニズムは完全には明らかにされないままです。最近の説得力のある証拠は、筋フィラメントの変化は、Ca ²⁺感度心筋細胞における細胞内Ca ²⁺恒常性およびイオンチャネルの活動に影響を及ぼしていること健康と病気の心の中で心臓の活動電位と収縮を担う不可欠なメカニズムを示しています。実際、心臓の活動電位の基礎となるイオンチャネルやトランスポーターの活動（ 例えば Na ^{+、 の} Ca ²⁺およびK ⁺チャネルおよびNa ⁺ -Ca ²⁺交換体）と細胞内Ca ²⁺のタンパク質（ 例えば 、リアノジン受容体およびCaの取り扱い筋小胞体（SERCA2aの）またはホスホランバンおよびそのリン酸化^）2+ -ATPaseは、従来evaluするために測定されます心臓の興奮収縮（EC）カップリングの基本的なメカニズムを食べました。筋フィラメントが収縮と弛緩の機能単位であり、筋フィラメント^の Ca ²⁺感受性が筋原繊維性能の実装では不可欠であるのに対し、膜と細胞内Ca ²⁺変化の両方の電気的活動は、ECカップリングのトリガ信号です。それが研究の焦点でない限り、それにもかかわらず、いくつかの研究では、心筋の機能解析に筋フィラメントのCa ²⁺感受性を組み込みます。ここでは、サルコメア短縮/再延長とのFura-2 AM（レシオメトリック検出）およびラット心臓から心筋細胞における筋フィラメントのCa ²⁺感受性の変化を評価を使用して、細胞内Ca ²⁺レベルを測定プロトコルを記述します。主な目的は、筋フィラメントのCa ²⁺感受性が機構的な分析のためのECカップリングに考慮されるべきであることを強調することです。私の総合的な調査翻訳および治療 ​​的価値のより効果的な戦略を設計するための貴重な情報を提供する健康と病気の心の中で筋細胞の収縮性を根底チャネル、イオントランスポーター、細胞内Ca ²⁺の取り扱い、および筋フィラメント^の Ca ²⁺感受性に。

概要

心臓の興奮収縮（EC）カップリングは、心筋の機械的特性を分析するための基本的なスキーム、 すなわち、心臓^1,2の収縮機能です。 ECカップリングは、筋細胞膜のイオンチャネル（ 例えば、パッチクランプ技術によって測定することができる電位依存性^{Na +}チャネル）の活性に対する二次膜の脱分極によって開始されます。 LTCCs を経由して 、その後の電位依存性L型の活性化のCa ²⁺チャネル（LTCCs）およびCa ²⁺流入は、ナノモル（nMでから細胞質ゾルCa ²⁺濃度を増加させ、リアノジン受容体（RyRs）を介してのCa ²⁺放出の大部分をトリガ）（μM）レベルをマイクロモル。細胞質ゾル^の Ca ²⁺におけるこのような増加は、細いフィラメント中のトロポニンC（TnCの）へのCa ²⁺結合を促進し、誘発フィラメント複合体の立体構造変化をアクチン-ミオシン相互作用を容易にし、myocardiを達成しますアルは^3を収縮しました。逆に、細胞質ゾルCa ^2+が SR中のCa ²⁺ -ATPaseを介して筋小胞体（SR）（SERCA2aの）に戻し再取り込まれる又はNa ⁺ / ^の Ca ²⁺交換器と原形質膜を介して筋細胞の外に押し出され、 Ca ²⁺ ATPアーゼ^1,2。その結果、細胞質ゾルのCaの減少は²⁺アクチン-ミオシンと筋細胞弛緩^1-3の解離の結果、元の状態に戻し細いフィラメントの立体構造変化を扇動します。ほとんどの哺乳動物の心臓細胞における¹細胞質ゾルのCa ^2+の除去の90％ -それは70を占めるので、この方式では、SERCA2aの活性は、一般に、心筋弛緩の速度を決定すると考えられます。このように、などLTCC、のRyRとのSERCA2a、による異常のCa ²⁺ハンドリングが疾患のある心臓^1-4で損なわれた収縮と弛緩のための主要なメカニズムと考えられてきました。

実際には^、2+総細胞内Caの約1％のECカップリング勘定のメッセンジャーおよびCa ²⁺の大部分として機能する細胞内Ca ²⁺バッファ^5,6にバインドされている無料のサイトゾル^の Ca ^2+。これは、様々なのCa ²⁺緩衝液は、 例えば、膜リン脂質、ATP、クレアチンリン酸、カルモジュリン、パルブアルブミン、筋原繊維のTnC、ミオシン、SERCA2aの、かつSRのカルセケストリン心筋細胞に豊富であるという事実にある^。5,6,7。これらの中でも、SERCA2aのとTnCのは、支配的なのCa ²⁺バッファ^5,6,7です。また、Caは^2+、そのバッファへの結合は単収縮時の動的なプロセスであり、追加の原因を結合のCa ²⁺の変化（ 例えば、Ca ^2+を 30〜50％が²⁺トランジェント⁷のTnCに結 ​​合し、カルシウムの間にそれから解離します）濃細胞内Ca ²⁺の変更で、細胞質ゾルに遊離Ca ²⁺の結果を「解放」entration。その結果、細胞内Ca ²⁺レベルの摂動は、収縮不全および不整脈^8,9の前駆体である異常な筋フィラメントの動きを誘導します。 （生理学的および病理学の両方）は、多くの要因が筋フィラメントのCa ²⁺バッファリングと筋フィラメントのCa ²⁺感受性^8-10に影響^を与える筋フィラメントタンパク質の転写後修飾の源とすることができます。最近では、のCa ²⁺トランジェント、異常のCa ²⁺放出、および不整脈⁸のポーズ依存増強を誘発、筋フィラメントタンパク質における突然変異は、Ca ²⁺結合親和性および細胞内Ca ²⁺ハンドリングを向上させることが報告されました。この考え方に沿って、我々はまた、神経型一酸化窒素合成酵素のアップレギュレーションに対する二次性高血圧ラット心臓における筋フィラメントのCa ²⁺の脱感作が上昇、拡張期と収縮期のCa ²⁺レベルに関連付けられていることが示されています今度は、のCa ²⁺依存性不活性化¹² LTCCの脆弱性を増加させる^11、。したがって、筋フィラメントのCa ²⁺感受性は、細胞内Ca ²⁺ホメオスタシスと筋細胞収縮機能の「アクティブ」な調節因子です。これは、筋フィラメントおよびCa ²⁺の間の相互作用、筋細胞、ECカップリング及び心臓機能の徹底的な調査のためのタンパク質の取り扱いを分析することが必要となってきています。

ここでは、孤立した心筋細胞における筋フィラメントのCa ²⁺感受性の変化を評価するプロトコルを記述します。細胞内Ca ²⁺プロファイル、筋フィラメントのCa ²⁺感受性および収縮の包括的な分析は、新規メカニズムを根底にある心筋の力学を発掘します。

プロトコル

プロトコルは健康の国連国立研究所によって公開実験動物の管理と使用に関する指針に従っている（NIH公開番号85-23、1996年改訂）。これは、ソウル大学（IACUC承認番号：SNU-101213から1）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.バッファーの調製（表材料および装置）

1. NaCl、135;のKCl、5.4;のMgCl _2、3.5;グルコース、5; HEPES、5;のNa ₂ HPO _4、0.4;タウリン、20; pH値：MMにおける実験（当日に新鮮な分離溶液300mlを準備7.4 NaOHで）。
2. CaCl ₂ 0.2; MgSO ₄を5;のKCl 5.4、NaClを120ナトリウム-ピルビン酸5; 5.5グルコース、タウリン20; HEPES 10;マンニトール29; pHは7.4：MMにおける実験（当日に新鮮なストレージソリューションの100ミリリットルを準備）NaOHで。
3. ;のKCl、4;のNaH ₂ PO _4、0.33;上記MgCのNaCl、141.4：mMの中の灌流液の1Lを（準備L ₂は、1。 HEPES、10;グルコース、5.5; CaCl _2、1.8;マンニトール、14.5; NaOHでpHを7.4）。
4. 分離を25 mlのコラゲナーゼ（1 mg / mlで）、プロテアーゼ（0.1 mg / mlで）、ウシ血清アルブミン（BSA、1.67mg / mlで）、およびCa ^2+（0.05ミリモル）を添加することによって、コラゲナーゼ溶液1を30mlの調製溶液。
5. 分離溶液16.7 mlに、BSA（1.67 mg / mlで）、およびCa ^2+（0.05ミリモル）を、コラゲナーゼ（1mg / ml）を添加することによって、コラゲナーゼ溶液2を20ミリリットルを準備します。
6. 分離溶液40mlにBSAを0.4gを添加することにより、BSA溶液40mlを調製します。 2ビーカーに10ミリリットルと30ミリリットルを区切ります。 BSA溶液中の最終Ca ²⁺濃度を1mMになるようにBSA溶液を30mlまでのCa ²⁺を加えます。

左心室（LV）筋細胞の単離2.準備

1. 調製および単離の部屋に動物施設からクリーンな輸送ケージに8-12週齢、雄のSprague-Dawley（SD）ラットを転送します。
2. H^37℃。に2水浴を食べます
   注：水のいずれかを使用水浴 - ジャケット付きリザーバとランゲンドルフ灌流システムの灌流チューブを。単一の筋細胞を分離するために、心筋組織のトランクを攪拌する他の水浴を使用してください。
3. それぞれ、30ミリリットルと20ミリリットルにボリュームを補うために5ミリリットル及びコラゲナーゼ溶液1と16.7ミリリットルコラゲナーゼ溶液2の25ミリリットルに（のCa ²⁺なし）BSA溶液の3.3ミリリットルを追加します。
4. それぞれ、ランゲンドルフ灌流システムにおける分離溶液（100ml）およびコラゲナーゼ溶液1（30mL）でカラム1（コロ1）および列2（コロ2）を追加する（ 図1A）。
5. ランゲンドルフ灌流システム（ 図1A）中の酸素接続管を介して、大佐1とCol.2で分離ソリューションおよびコラゲナーゼ溶液1に酸素。同様に、含酸素コラゲナーゼ溶液2とを経由して 100％のO ₂との振盪水浴中のBSA溶液酸素接続チューブ。

LV筋細胞の3分離

1. ペントバルビタールナトリウム（30mg / kg）の腹腔内注射を介して、SDラットを麻酔し、ピンチつま先と撤退反射の欠如によって麻酔状態を確認。
2. 解剖トレイにラットを移動します。仰臥位では、テープで本体の側面に4脚を固定します。
3. 心を傷つけないように確実に、胸を開くために手術用ハサミで胸部半ば軸切開を適用します。接続血管（ 例えば、スーペリア、下大静脈、肺血管、および大動脈）と心膜膜¹³から心臓を解剖するためにきれいなハサミの別のペアを使用してください。
4. 細かい鉗子で大動脈をクランプ、 - （8ミリメートル5）、および急速に1分（ 図1A）内ランゲンドルフ灌流システムのカニューレを取り付けるのに十分な長さの大動脈の一部を残します。大動脈の上にしっかりと縫合糸4/0を接続します。
5. は大佐1のバルブの電源をオンにし、10分間予熱したと酸素分離液（灌流速度：12〜14ミリリットル/分）で分離された心臓を灌流。 、大佐1のバルブをオフにし大佐2のバルブをオンにして、8のためのコラゲナーゼ溶液1で心臓を潅流 - 10分。
6. 大動脈を切断することにより、消化心のマウントを解除し、新鮮な分離溶液（ 図1Bi）を含むフラスコに鉗子で大動脈を保持することによって、それを転送します。小さ ​​な断片（〜22ミリメートル、 図1Bii）に（中隔を含む）、LV自由壁の大部分をカットする細かいハサミやピンセットを使用してください。
7. 予熱したと酸素新鮮なコラゲナーゼ溶液2（ 図1Biii）を含むフラスコにピースを転送します。 10分間振ります。筋細胞を含むコラゲナーゼ溶液2に酸素を提供してください。
8. 吸引電球でドロッパーを用いて10 mlの遠心チューブにサスペンションおよびCa ^2+を追加- -筋細胞を移動（BSA溶液を含みます1：ボリューム内の1）。 2分間の30グラムで遠心分離し、上清を捨てます。 BSA溶液5ml中の筋細胞ペレットを再懸濁します。上清を遠心分離し、廃棄します。
9. 筋細胞ペレットを分散し、RT（ 図1Biv-VI）で予備酸素ストレージソリューションの10ミリリットルで筋細胞を維持します。
10. フラスコ内の残りのLV組織と - （3.9 3.7ステップ）の手順を繰り返します。
    LV組織のほとんどは筋細胞の良好な収率を得るために消えるまで再び - （3.9 3.7ステップ）の手順を繰り返してください：注意してください。
11. 実験の終了まで室温で6-8時間のためのストレージソリューションに筋細胞を保管してください。

細胞内Ca ²⁺過渡状態と筋細胞の収縮の4同時測定

1. アセトキシメチルエステルのFura-2 AM（2μM）でロードLV筋細胞。
   注：ダークチューブ（ 図1Bvii）にロードされた筋細胞を持つすべてのロード手順と実験を行います。
   1. CENTR10秒間2000×gで筋細胞懸濁液（1ml）にifuge。上清を捨て、低Ca ²⁺濃度（250μM、表材料および装置）とのタイロード溶液の1ミリリットル中の筋細胞ペレットを再懸濁。
   2. 軽く筋細胞懸濁液を分散させる、のFura-2AMとポロキサマー407（2μl）を追加し、室温で混合物を維持- 15分間（20〜24 ^Oの C）（ 図1Bvii）。
   3. 遠心分離は、混合物を5秒間、上清を廃棄し、500μMのCa ^2+を含む灌流液の1ミリリットルで筋細胞ペレットを分散させます。 10分後、5秒間混合物を遠心分離し、上清を捨てます。
   4. 新鮮な灌流液（500μMのCa ^2+、1ミリリットル）を追加し、フラ- 2AM保つ-レコーディングのために、この溶液中にロードされた筋細胞ペレットを。
2. LV筋細胞の収縮と細胞内Caの測定²⁺
   1. 記録する前に、通る灌流チューブを埋めます36 ^O℃に予熱したあるタイロード溶液、水ジャケット
   2. 8分 - 5のための倒立蛍光顕微鏡のチャンバーにロードされたLV筋細胞サスペンション - フラ2 AMの数滴を置きます。ゆっくりタイロード溶液（2.2ミリリットル/分）を灌流。
   3. フィールド刺激（2 Hz）を開始するデジタル刺激装置の前面パネルにある「スタート」ボタンを押してください。
      注：出力電圧（10 V、5ミリ秒の持続時間）は、チャンバの両側に位置する白金線を介してチャンバ内の筋細胞に適用されます。
      1. その記録のための契約を安定（ハイパーまたはハイポ収縮が表示されていないもの）筋細胞を選択します。
   4. ビデオベースの筋節検出システムの水平位置に選択肢の筋細胞を調整し、サルコメアの最適な画像を得るために顕微鏡の焦点を調整します。明確な筋節が明らかに平均するまで観察されている領域に紫の長方形のボックスを配置しますサルコメア長（赤ピーク）の特異鋭いピーク（ 図2A、下の画像）が表示されます。
   5. フィールド刺激（ 図2AおよびB）に応答して、筋節長の変化を記録します。
      注：1にロード筋細胞を使用してください - 2時間。
   6. ビデオベースの筋節検出システムのフィールドが筋細胞（ 図2A）の大きさになるようにカメラの絞りを調整します。 510 nmの（買収周波数千ヘルツ）で360ナノメートル/ 380 nmでの励起および発光で筋細胞を刺激します。録音サルコメア短縮とフィールド刺激（ 図2B）とFURA2 AM比。

筋フィラメントのCa ²⁺感受性の5評価

1. サルコメアの長さと定常状態で^の Ca ²⁺過渡電流の平均（10から20までのトレース）と（両方の測定値と同じ筋細胞の筋節長対のFura-2比の位相面のループをプロットsおよびデルタ変化; 図2C）。
2. 各プロットでは、50％の弛緩（EC _50、 図2C）でフラ-2比を定義します。各介入のループおよびEC ₅₀の両方を比較してください。

結果

LV筋細胞は、正常と高血圧ラット心臓から単離されます。フィールドの刺激に応答して、明確な条線（サルコメアを表す）、安定した収縮との棒状筋細胞は、最適な筋細胞であると考えられていると録音（ 図2A）のために選択されています。 Fのigure 2Aに示す例では、フラ2 AMは、LV筋細胞が水平に配置され、筋細胞、記録フィールドの大部分?...

ディスカッション

ここでは、単一の孤立心筋細胞における筋フィラメントのCa ²⁺感受性の変化を評価し、電気生理学的特性、細胞内Ca ²⁺過渡電流、および筋フィラメント動態と一緒に、このパラメータを測定することの重要性を強調するためのプロトコルを記述します。パラメータの一つまたは二つの記録は、心臓の収縮と弛緩のメカニズムを解明しない場合があるからです。個別に¹?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM