Оценка Myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Чувствительность В основе сердечного возбуждения-сжатия муфты

Резюме

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Аннотация

Сердечная недостаточность и нарушения ритма сердца являются основными причинами смертности и заболеваемости во всем мире. Тем не менее, механизм патогенеза и миокардиальной неисправностью в больном сердце остается полностью выяснены. Последние убедительные данные свидетельствуют о том, что изменения в myofilament Ca ²⁺ чувствительности влияет на внутриклеточный Ca ²⁺ гомеостаз и ионных каналов деятельность в кардиомиоциты, основные механизмы , ответственные за потенциала действия сердца и сжатия у здоровых и больных сердец. Действительно, деятельность ионных каналов и транспортеров , лежащие в основе потенциалов действия сердца (например, Na ^+, Ca ²⁺ и K ⁺ каналов и Na ⁺ -Ca ²⁺ обменника) и внутриклеточного Са ²⁺ обработки белки (например., Рианодин рецепторы и Ca ²⁺ -АТФазы в саркоплазматического ретикулума (SERCA2a) или phospholamban и его фосфорилирования) традиционно измеряется в оценели фундаментальных механизмов сердечного возбуждения-сжатия (EC) муфты. Обе электрические действия в мембране и внутриклеточных изменений Са ²⁺ являются синхросигналы сцепления ЕС, в то время как myofilament является функциональной единицей сокращения и расслабления, и myofilament Ca ²⁺ чувствительности является обязательным при осуществлении миофибрилл производительности. Тем не менее, несколько исследований включают myofilament Ca ²⁺ чувствительности в функциональном анализе миокарда , если он не находится в центре внимания исследования. Здесь мы опишем протокол , который измеряет саркомер сокращения / повторного удлинения и внутриклеточный уровень Са ²⁺ с использованием Фура-2 AM (ратиометрический обнаружения) и оценить изменения myofilament Ca ²⁺ чувствительности в кардиомиоцитов из сердца крысы. Основная цель состоит в том, чтобы подчеркнуть , что myofilament Ca ²⁺ чувствительности следует принимать во внимание в муфте EC для механистического анализа. Комплексное исследование Iна каналах, ионные транспортеры, внутриклеточная обработки Ca ²⁺ и Ca ²⁺ myofilament чувствительности, лежащих в основе миоцитов сократимость у здоровых и больных сердца предоставит ценную информацию для разработки более эффективных стратегий поступательной и терапевтическую ценность.

Введение

Сердечный возбуждения-сжатия (EC) связи является основной схемой для анализа механических свойств миокарда, т.е. сократительной функции сердца ^1,2. Муфта EC инициируется деполяризации мембраны вторичным по отношению к деятельности сарколемных ионных каналов (например, напряжения закрытого Na ⁺ канал, который можно измерить с помощью методов патч-зажим). После активации напряжения закрытого L-типа Ca ²⁺ каналы (LTCCs) и Са ²⁺ приток через LTCCs вызывают большую часть Ca ²⁺ через выпуск рианодиновых рецепторов (RyRs), увеличение концентрации цитозольного Са ²⁺ из наномолярной (Nm ) до микромолярные (мкМ) уровень. Такое увеличение цитозольного Ca ²⁺ способствует Са ²⁺ связывания с тропонина С (TNC) в тонких нитях и вызывает конформационные изменения комплекса синтетических нитей , чтобы облегчить взаимодействие актина-миозина и достигает myocardiАль контракции ^3. С другой стороны , цитозольного Ca ²⁺ повторно uptaken обратно в саркоплазматического ретикулума (СР) через Ca ²⁺ -АТФазы в SR (SERCA2a) или выдавливают из миоцита через Na ⁺ / Ca ²⁺ обменника и plasmalemmal Ca ²⁺ АТФазы ^1,2. Следовательно, снижение цитозольного Ca ²⁺ подстрекает конформационные изменения тонких нитей обратно в исходное состояние, что приводит к диссоциации актин-миозин и миоцитов релаксации ^1-3. В этой схеме, активность SERCA2a , как правило , считается , чтобы определить скорость релаксации миокарда , поскольку она составляет 70 - 90% от цитозольной удаления Ca ²⁺ в большинстве млекопитающих клеток сердца ^1. В качестве такого, ненормального обработка Ca ²⁺ LTCC, RyR и SERCA2a и т.д. были рассмотрены основные механизмы нарушенной сократимости и релаксации в сердце больном ^1-4.

На самом деле, свободный цитозольного Ca ²⁺ , который функционирует как посланному на счетах сцепных ЕС для около 1% от общего внутриклеточного Са ²⁺ и большинство Са ²⁺ связывается с внутриклеточными Ca ²⁺ буфера ^5,6. Это связано с тем , что различные Са ²⁺ буферы в изобилии в кардиомиоциты, например, мембранные фосфолипиды, АТФ, креатинфосфата, кальмодулин, парвальбумина, миофибрилла TnC, миозин, SERCA2a и calsequestrin в СР. ^5.6.7. Среди них, SERCA2a и TnC являются преобладающими Са ²⁺ буферов ^5,6,7. Кроме того, связывание Са ²⁺ с его буферами представляет собой динамический процесс во время подергивания (например, 30-50% Са ²⁺ связывается с TnC и отмежеваться от него во время Са ^{2+ 7)} и изменения в Ca ²⁺ связывания причиной дополнительного "освобождение" свободного Са ²⁺ в цитозоле, приводит к переделок внутриклеточного Са ²⁺ концentration. Следовательно, возмущение внутриклеточного уровня Са ²⁺ вызывает аномальные движения myofilament, которые являются предшественниками сократительной дисфункции и аритмий ^8,9. Многие факторы (как физиологические и патологические) могут быть источниками посттранскрипционных модификаций myofilament белков, которые влияют на myofilament Са ²⁺ буферизация и myofilament Ca ²⁺ чувствительности ^8-10. Недавно было сообщено о том, что мутации в myofilament белки увеличивают Са ²⁺ сродство связывания и внутриклеточного обработку Ca ^2+, вызывая паузы зависящих от потенцирование Ca ^2+, Ca ²⁺ ненормальным релиз и аритмий ^8. В соответствии с этой концепцией, мы также показали , что myofilament Ca ²⁺ десенсибилизации в гипертоников сердцах крыс вторичным по отношению к регуляцию нейрональной синтазы оксида азота связан с повышенным уровнем диастолического и систолического Ca ²⁺ уровней^11, который , в свою очередь, повышает уязвимость к LTCC Ca ²⁺ -зависимые инактивация ^12. Следовательно, myofilament Ca ²⁺ чувствительность является "активным" регулятором внутриклеточного Ca ²⁺ гомеостаза и сократительной функции кардиомиоцитов. Стало необходимо проанализировать взаимодействие между myofilament и Ca ²⁺ обработка белков для тщательного изучения миоцитов сцепления EC и сердечной функции.

Здесь мы опишем протокол , который оценивает изменения myofilament Ca ²⁺ чувствительности в изолированных кардиомиоцитов. Комплексный анализ внутриклеточного Ca ²⁺ профиль, myofilament Ca ²⁺ чувствительность и сжатие будет раскопать романа механизмы , лежащие в миокарде механики.

протокол

Протокол в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованных Национальным институтом ООН здоровья (NIH Publication No. 85-23, пересмотренная 1996). Он был утвержден по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) Сеульского национального университета (утверждения IACUC № .: СНУ-101213-1) путем.

1. Буфер Подготовка (Таблица Материалы и оборудование)

1. Готовят 300 мл свежего раствора изоляции на день эксперимента (в мМ: NaCl 135; KCl 5,4, MgCl _2, 3,5; глюкоза, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; таурин, 20; рН 7,4 с помощью NaOH).
2. Приготовьте 100 мл раствора свежего хранения на день эксперимента (в мМ: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0,2; натрий-пируват 5; глюкоза 5,5; таурин 20; HEPES , 10; маннитол 29; рН 7,4 с помощью NaOH).
3. Готовят 1 л раствора перфузии (в мМ: NaCl, 141.4, KCl, 4, NaH ₂ PO _4, 0,33; MGCл _2, 1; HEPES, 10; глюкоза, 5,5; CaCl _2, 1,8; маннита, 14,5; рН 7,4 с помощью NaOH).
4. Приготовьте 30 мл раствора коллагеназы 1 путем добавления коллагеназы (1 мг / мл), протеазу (0,1 мг / мл), бычий сывороточный альбумин (БСА, 1.67mg / мл) и Са ²⁺ (0,05 мМ) в 25 мл изоляции решение.
5. Приготовьте 20 мл раствора коллагеназы 2 путем добавления коллагеназы (1 мг / мл), бычий сывороточный альбумин (1,67 мг / мл) и Са ²⁺ (0,05 мМ) до 16,7 мл раствора изоляции.
6. Приготовьте 40 мл раствора БСА добавлением 0,4 г бычьего сывороточного альбумина в 40 мл раствора изоляции. Раздельное 10 мл и 30 мл в двух стаканах. Добавить Ca ²⁺ до 30 мл раствора БСА таким образом, чтобы конечная концентрация Са ²⁺ в растворе БСА составляет 1 мм.

2. Подготовка к изоляции левого желудочка (ЛЖ) миоцитов

1. Передача 8-12-недельных, мужские Sprague-Dawley (SD) крыс в чистых транспортных клетках из вивария для подготовки и изоляции помещения.
2. ЧАСесть два водяные бани до 37 ^о С.
   Примечание: Используйте один водяной бане в воду - резервуар с рубашкой и перфузионных трубок системы перфузионного Лангендорфа. Используйте другую ванну воды для того чтобы агитировать стволы ткани миокарда, чтобы отделить единичные миоциты.
3. Добавляют 5 мл и 3,3 мл раствора БСА (без Са ²⁺⁾ к 25 мл раствора коллагеназы 1 и 16,7 мл раствора коллагеназы 2 , чтобы компенсировать объем до 30 мл и 20 мл, соответственно.
4. Добавить раствор изоляции (100 мл) и раствором коллагеназы 1 (30 мл) в колонку 1 (Кол 1) и колонки 2 (Кол 2) в системе Лангендорфа перфузионного, соответственно (Рис . 1А)
5. Оксигенации раствора изоляции и раствором коллагеназы 1 в Кол.1 и Кол.2 через соединение кислорода трубки в перфузионной системе Лангендорфа (рис 1А). Точно так же, кислородсодержащих соединений раствор 2 коллагеназы и раствор БСА в встряхивании на водяной бане со 100% O ₂ черезкислорода соединительной трубки.

3. Выделение миоцитов Л.В.

1. Обезболить на SD крыс через внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (30 мг / кг) и подтвердить обезболивающий статус носком сдавливания и отсутствие абстинентного отражения.
2. Перемещение крысы рассечение лотка. В положении лежа на спине, закрепите четыре ноги по бокам тела с лентой.
3. Применить грудные середине осевые разрезы с хирургическими ножницами, чтобы открыть сундук, обеспечивая, чтобы не повредить сердце. Используйте другую пару чистых ножницами , чтобы рассекать сердце из сообщающихся сосудов (например, верхней и нижней полой вене, легочных сосудов и аорты) и перикарда мембраны ^13.
4. Оставьте часть аорты достаточной длины (5 - 8 мм), зажим аорты с тонким пинцетом, и быстро монтировать канюлю системы перфузионного Лангендорфа в течение 1 мин (фиг.1А). Tie шовная нить 4/0 плотно над аортой.
5. Включите клапан на Кол.1 и заливать изолированное сердце с предварительно нагретым и насыщенным кислородом раствором изоляции в течение 10 мин (скорость перфузии: 12-14 мл / мин). Выключите клапан на Кол.1, включите клапан на Седло 2 и заливать сердце с раствором коллагеназы 1 для 8 - 10 мин.
6. Демонтировать переваренной сердце путем разрезания аорту и передать его, удерживая аорту с пинцетом в колбу , содержащую свежий раствор изоляции (рис 1Bi). Используйте тонкие ножницы и пинцет , чтобы вырезать большую часть свободной стенки левого желудочка ( в том числе перегородку) на более мелкие куски (~ 22 мм, рис 1Bii).
7. Передача части в колбу , содержащую предварительно нагретым и насыщенным кислородом свежим раствором коллагеназы 2 (рис 1Biii). Встряхивают в течение 10 мин. Хранить доставки кислорода к миоцитов раствора, содержащего коллагеназы 2.
8. Перемещение миоцит - суспензии в 10 мл центрифужные пробирки с помощью капельницы с всасывающим луковице и добавить Ca ²⁺ - раствор , содержащий БСА (1: 1 по объему). Центрифуга на 30 г в течение 2 мин и отбросить супернатант. Повторное приостановить миоцитов осадок в 5 мл раствора БСА. Центрифуга и отбросить супернатант.
9. Дисперсные миоцита гранул и держать миоцитов в 10 мл раствора для хранения предварительно насыщенной кислородом при комнатной температуре (рис 1Biv-VI).
10. Повторите процедуры (шаги 3.7 - 3.9) с оставшейся ткани ЛЖ в колбе.
    Примечание: Продолжайте повторять процедуры (шаги 3.7 - 3.9), пока большая часть ткани левого желудочка не исчезает, чтобы получить хороший выход миоцитов.
11. Хранить миоциты в растворе для хранения в течение 6-8 ч при комнатной температуре до конца эксперимента.

4. Одновременные измерения внутриклеточного Са ²⁺ и миоцитов Относительное сужение

1. Нагрузка LV миоциты с ацетоксиметил эфира фура-2 AM (2 мкМ).
   Примечание: Выполните все процедуры загрузки и эксперименты с заряженными миоцитов в темной трубке (рис 1Bvii).
   1. Centrifuge миоцитов суспензию (1 мл) при 2000 х г в течение 10 сек. Удалите супернатант и повторно приостанавливать миоцитов осадок в 1 мл раствора Тироде с низкой концентрацией Ca ²⁺ (250 мкМ, Таблица материалов и оборудования).
   2. Добавить фура-2АМ и полоксамер 407 (2 мкл), мягко рассеивать миоцитов суспензии, и держать смесь при комнатной температуре (20 - 24 ^° С) в течение 15 мин (рис 1Bvii).
   3. Центрифуга смесь в течение 5 сек, отбросить супернатант и разогнать миоцитов осадок в 1 мл перфузионного раствора , содержащего 500 мкМ Са ^2+. Через 10 мин, центрифугируют смесь в течение 5 сек и отбросить супернатант.
   4. Добавить свежий перфузионный раствор (500 мкМ Са2 ^+, 1 мл) и держать фура-2 утра - загруженную миоцитов осадок в этом растворе для записей.
2. Измерение LV миоцитов сжатия и внутриклеточного Са ²⁺
   1. Перед записью, заполнить трубку перфузионного, которая проходит черезВодяная рубашка с раствором Тироде, который предварительно нагревают до 36 ^о С.
   2. Поместите несколько капель Fura 2 AM - загруженная LV миоцитов подвеска на камеру перевернутой флуоресцентного микроскопа для 5 - 8 мин. Медленно заливать раствор Тироде (2,2 мл / мин).
   3. Нажмите кнопку "Пуск" на передней панели цифрового стимулятора, чтобы начать стимуляцию поля (2 Гц).
      Примечание: Выходное напряжение (10 В, 5 мсек) применяется к миоцитов в камере через платиновые провода, расположенные по обе стороны камеры.
      1. Выберите миоциты, что контракт стабильно (не те, показывая гипер- или гипо- сжатия) для записи.
   4. Отрегулируйте миоцит выбора в горизонтальном положении системы обнаружения саркомера видеопрограмм и настроить фокус микроскопа для получения оптимальных изображений саркомеров. Поместите фиолетовый прямоугольник на область, в которой ясно саркомеры четко не наблюдается до среднегодлин саркомера (красный пик) отображает уникальный резкий пик (рис 2А, нижний рисунок).
   5. Запишите изменения длины саркомера в ответ на стимуляцию поля (рис 2А и В).
      Примечание: Используйте загруженные миоцитов в течение 1 - 2 ч.
   6. Отрегулируйте диафрагму камеры таким образом , чтобы поле в системе обнаружения саркомер видео на основе является размер миоцитов (рис 2А). Стимулируют миоцит с возбуждением на 360 нм / 380 нм и излучение на длине волны 510 нм (частота приобретения 1000 Гц). Запись саркомер укорочение и отношение фура2 АМ при стимуляции поля (рис 2В).

5. Оценка Myofilament Ca ²⁺ Чувствительность

1. Среднее значение на основании длины саркомера и Ca ²⁺ в стационарном состоянии (10 - 20 следов) и участок контура фазовой плоскости соотношения Fura-2 против длины саркомера того же миоцита (оба с измеренным значениемс и дельта изменения; рис. 2в)
2. В каждом участке, определяют соотношение Фура -2 при 50% релаксации (EC _50, Рис 2С). Сравните оба цикла и EC ₅₀ каждого вмешательства.

Результаты

миоциты LV изолированы от нормальных, так и с гипертонической болезнью сердца крысы. В форме стерженьков миоциты с четкими страт (представляющих саркомеры) и стабильных сокращений в ответ на стимуляцию поля считаются оптимальными миоциты и выбраны для записей (ри?...

Обсуждение

Здесь мы описываем протоколы для оценки изменений myofilament Ca ²⁺ чувствительности в одной изолированной сердечной миоцита и подчеркнуть важность измерения этого параметра наряду с электрофизиологических свойств, внутриклеточный Ca ^2+, и динамику myofilament. Это происходит потому, ч...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM