הערכת Myofilament Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; עירור-התכווצות לב ביסוד רגישה זיווגים

Summary

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Abstract

אי ספיקת לב והפרעות קצב הלב הם הגורמים המובילים לתמותה ותחלואה בעולם. עם זאת, המנגנון של מחלה ו תקלת שריר לב בלב החולה נשאר להתברר במלואה. ראיות משכנעות אחרונות מוכיחות כי שינויים ברגישות ²⁺ myofilament Ca להשפיע Ca התאי ²⁺ פעילויות הומאוסטזיס יון ערוץ myocytes הלב, המנגנונים החיוניים אחראים פוטנציאל הפעולה של הלב והתכווצות בלבבות בריאים וחולים. ואכן, פעילויות של תעלות יונים מובילי שבבסיס פוטנציאל פעולת לב (למשל, Na ^+, Ca ^{2 +} ו K ⁺ ערוצים מחליפים Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ ו- CA תאי ²⁺ טיפול חלבונים (למשל., קולטנים ryanodine ו- CA ²⁺ -ATPase ב הרטיקולום sarcoplasmic (SERCA2a) או phospholamban ו זירחון שלה) נמדדים כמקובל כדי evaluאכול את המנגנונים הבסיסיים של התכווצות עירור לב (EC) צימוד. שני פעילויות חשמל בקרום והשינויים ²⁺ Ca התאיים הן אותות ההדק של צימוד EC, ואילו myofilament היא היחידה התפקודית של התכווצות והרפיה, ו myofilament Ca רגיש ²⁺ הכרחית ביישום ביצועי myofibril. אף על פי כן, כמה מחקרים לשלב myofilament רגישות Ca ^{2 +} לתוך האנליזה הפונקציונלית של שריר הלב, אלא אם כן הוא המוקד של המחקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול המודד קיצור sarcomere / מחדש התארכות ורמת תאיים Ca ^{2 +} באמצעות פורעה -2 AM (זיהוי ratiometric) ולהעריך את השינויים של רגישות ²⁺ myofilament Ca ב myocytes לב מלבבות חולדה. המטרה העיקרית היא להדגיש myofilament שרגישות ²⁺ Ca צריכה להילקח בחשבון צימוד EC לניתוח מכניסטית. חקירה מקיפה של iבערוצים, מובילי יון, טיפול Ca ^{2 +} תאיים, ורגישות ²⁺ myofilament Ca העומדים בבסיס התכווצות myocyte בלבבות בריאים וחולים יספק מידע רב ערך לתכנון אסטרטגיות יעילות יותר של translational ואת הערך טיפולי.

Introduction

צימוד עירור-התכווצות הלב (EC) הוא ערכת היסוד לניתוח תכונות מכניות של שריר הלב, כלומר, הפונקציה התכווצות של הלב ^1,2. צימוד EC הוא שיזם שלילת קוטביות הממברנה משנית לפעילות של תעלות יונים sarcolemmal (למשל, ערוץ Na ⁺ מתח מגודרת, אשר ניתן למדוד באמצעות טכניקות תיקון- clamp). ההפעלה הבאה של זרם מתח מגודר L- סוג Ca ^{2 +} ערוצים (LTCCs) ו Ca ^{2 +} דרך LTCCs לעורר את חלק הארי של Ca ^{2 +} שחרור דרך קולטני ryanodine (RyRs), גברת ריכוז cytosolic Ca ^{2 +} מ nanomolar (ננומטר ) כדי מיקרו ברמה (מיקרומטר). כגון עלייה Ca cytosolic ²⁺ מקדמת Ca ^{2 +} מחייבת טרופונין C (TNC) ב חוטים דקים מעוררת שינויים מרחביים של מתחם הנימה כדי להקל על האינטראקציה תקטין שרירן ומשיגה myocardi אל התכווצות ^3. מנגד, cytosolic Ca ^{2 +} מחדש uptaken בחזרה הרטיקולום sarcoplasmic (SR) דרך Ca ^{2 +} -ATPase ב SR (SERCA2a) או הנמתח מן myocyte באמצעות מחליפי Na ⁺ / Ca ^{2 +} ואת plasmalemmal Ca ^{2 +} ATPase ^1,2. כתוצאה מכך, הירידה Ca cytosolic ²⁺ instigates שינויים מרחביים של חוטים דקים חזרה למצב המקורי, וכתוצאה מכך ניתוק של אקטין שרירן myocyte הרפיה ^1-3. לפי שיטה זו, את הפעילות של SERCA2a נחשבת בדרך כלל כדי לקבוע את המהירות של הרפיה שריר הלב כי זה חשבונות עבור 70 - 90% של הסרת cytosolic Ca ^{2 +} ברוב תאי לב יונקים ^1. ככזה, טיפול Ca ²⁺ נורמלי ידי LTCC, RyR ו SERCA2a, וכו 'כבר נחשב המנגנונים העיקריים עבור התכווצות לקויה ורוגע בלב החולה ^1-4.

> במציאות, חינם cytosolic Ca ^{2 +} שמתפקד השליח בחשבונות צימוד EC כ 1% בסך הכל Ca תאיים ²⁺ ואת רוב Ca ^{2 +} מאוגד מאגרים תאיים Ca ^{2 + 5,6.} זאת בשל העובדה כי מאגרים שונים Ca ²⁺ נמצאים בשפע myocytes לב, למשל, פוספוליפידים בממברנה, ATP, phosphocreatine, calmodulin, parvalbumin, myofibril TNC, שרירן, SERCA2a, ו calsequestrin ב SR. ^5,6,7. ביניהם, SERCA2a ו TNC הם מאגרי Ca ²⁺ השולט ^5,6,7. יתר על כן, Ca ^{2 +} מחייב המאגרים שלה הוא תהליך דינמי במהלך עווית (למשל, 30-50% של Ca ^{2 +} נקשרו TNC ו לנתק ממנו במהלך Ca ^{2 +} ארעיים ⁷⁾ ושינוי Ca ^{2 +} מחייב גורם נוסף "לשחרר" של חינם Ca ^{2 +} אל cytosol, תוצאות בהתאמות של Ca התאי ²⁺ קונצרט כלשהוentration. כתוצאה מכך, הפרעות של רמת תאיים Ca ^{2 +} גורמות תנועות myofilament חריגות, אשר הן המבשרים של חוסר תפקוד התכווצות והפרעות קצב ^8,9. גורמים רבים (הן פיזיולוגיים ופתולוגיים) יכול להיות מקורות שינויים שלאחר תעתיק של חלבונים myofilament, המשפיעים חציצה myofilament Ca ²⁺ myofilament רגישות Ca ^{2 + 8-10.} לאחרונה, דווח כי מוטציות בחלבוני myofilament להגדיל את Ca ^{2 +} זיקה מחייבת וטיפול תאיים Ca ^{2 +,} מפעיל הגברה תלוית הפסקה של Ca ^{2 +} ארעי, חריגת Ca ^{2 +} שחרור, הפרעות קצב ^8. עולים בקנה אחד עם המושג הזה, אנחנו גם הראינו כי הפחתת רגישות myofilament Ca ²⁺ בלבבות חולדה עם יתר לחץ דם משתי לרגולציה-אפ של synthase תחמוצת חנקן העצבית קשורות הדיאסטולי מוגבה סיסטולי Ca ^{2 +} רמות^11, אשר בתורו, מגביר את הפגיעות של LTCC כדי האיון התלוי ²⁺ Ca ^12. לפיכך, רגישות ²⁺ myofilament Ca הוא רגולטור "פעיל" של פונקצית התכווצות הומאוסטזיס תאית Ca ^{2 +} ו myocyte. זה הפך להיות צורך לנתח אינטראקציות בין myofilament ו Ca ^{2 +} טיפול חלבונים לחקירה יסודית של צימוד myocyte EC ותפקוד הלב.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מעריך את השינויים של רגישות ²⁺ myofilament Ca ב myocytes לב מבודד. ניתוח מקיף של פרופיל תאיים Ca ^{2 +,} Ca ^{2 +} myofilament רגישות וההתכווצות לחפור מנגנוני רומן מכניקת שריר לב בסיסית.

Protocol

הפרוטוקול הוא בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שפורסם על ידי המכונים הלאומיים האו"ם הבריאות (פרסום NIH מס 85-23, מתוקנת 1996). זה אושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית בסיאול (אישור IACUC לא .: SNU-101,213-1).

הכנת הצפה 1. (חומרי שולחן וציוד)

1. הכן 300 מ"ל של פתרון בידוד טריים ביום של הניסוי (מ"מ: NaCl, 135; KCl, 5.4; ₂ MgCl, 3.5; גלוקוז, 5; HEPES, 5; Na _{2 4} HPO, 0.4; טאורין, 20; pH 7.4 עם NaOH).
2. הכן 100 מ"ל של פתרון אחסון טריים ביום של הניסוי (מ"מ: 120 NaCl; KCl 5.4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0.2; נתרן-פירובט 5; גלוקוז 5.5; טאורין 20; HEPES 10; מניטול 29; pH 7.4 עם NaOH).
3. הכן 1 ליטר של פתרון זלוף (מ"מ: NaCl, 141.4; KCl, 4; לאא _{2 4} PO, 0.33; MGCl _2, 1; HEPES, 10; גלוקוז, 5.5; ₂ CaCl, 1.8; מניטול, 14.5; pH 7.4 עם NaOH).
4. הכן 30 מ"ל של תמיסת collagenase 1 על ידי הוספת collagenase (1 מ"ג / מ"ל), פרוטאז (0.1 מ"ג / מ"ל), אלבומין בסרום שור (BSA, 1.67mg / מ"ל), ו Ca ^{2 +} (0.05 מ"מ) עד 25 מ"ל של בידוד פִּתָרוֹן.
5. הכן 20 מ"ל של תמיסת collagenase 2 על ידי הוספת collagenase (1 מ"ג / מ"ל), ארגון ה- BSA (1.67 מ"ג / מ"ל), ו Ca ^{2 +} (0.05 מ"מ) 16.7 מ"ל של פתרון בידוד.
6. הכן 40 מ"ל של תמיסת BSA על ידי הוספת 0.4 גרם של BSA 40 מ"ל של פתרון בידוד. הפרד 10 מ"ל ו -30 מ"ל לשתי כוסות. הוספת Ca ^{2 +} 30 מ"ל של תמיסת BSA כך הריכוז הסופי Ca ^{2 +} בתמיסה BSA הוא 1 מ"מ.

2. הכנה עבור הבידוד של החדר השמאלי (LV) myocytes

1. עבר 8-12 בן שבוע, ספראג-Dawley זכר (SD) חולדות בכלובי תחבורה נקיות ממתקן החיה לחדר ההכנה ובידוד.
2. Hלאכול שתי אמבטיות מים ל -37 ^מעלות צלסיוס
   הערה: השתמש באמבט מים אחד על המים - המאגר במקטורן ואת צינורות טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. השתמש באמבט מים אחרים כדי להתסיס גזעי רקמת שריר הלב על מנת להפריד myocytes יחיד.
3. הוסף 5 מ"ל ו 3.3 מ"ל של תמיסת BSA (ללא Ca ^{2 +)} ל -25 מ"ל של collagenase פתרון 1 פתרון collagenase 16.7 מ"ל 2 לפצות את נפח 30 מ"ל ו 20 מ"ל, בהתאמה.
4. הוסף פתרון הבידוד (100 מ"ל) ו collagenase פתרון 1 (30 מ"ל) לעמודה 1 (אל"מ 1) ועמודה 2 (אל"מ 2) במערכת זלוף Langendorff, בהתאמה (איור 1 א).
5. חמצן פתרון הבידוד collagenase פתרון 1 אל"מ 1 ו Col.2 דרך צינור חיבור חמצן במערכת זלוף Langendorff (איור 1 א). בדומה לכך, פתרון collagenase oxygenate 2 והפתרון BSA באמבט מים רועד 100% O ₂ דרךצינור חיבור חמצן.

3. בידוד של LV myocytes

1. להרדים חולדה SD באמצעות זריקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (30 מ"ג / ק"ג) ולאשר את מצב הרדמה על ידי הבוהן צובט וחוסר השתקפות הנסיגה.
2. הזז את החולדה מגש לנתיחה. במצב שכיבה, לאבטח את ארבע רגליו אל צידי הגוף עם קלטת.
3. החל חתכים-ציריים באמצע חזה עם מספרי כירורגיות כדי לפתוח את החזה, הבטחה שלא לפגוע בלב. השתמש עוד זוג מספרי נקי לנתח את הלב מכלי החיבור (למשל, הווריד נבוב עליון ונחות, כלי ריאתי, ואב עורקים) ואת קרום קרום לב ^13.
4. השאירו חלק של אבי העורקים של אורך מספיק (5 - 8 מ"מ), מהדק את אבי העורקים עם מלקחיים בסדר, במהירות הר צינורית של מערכת זלוף Langendorff בתוך דקות 1 (איור 1 א). לקשור תפר חוט 4/0 בחוזקה על אבי העורקים.
5. הפעל את שסתום על אל"מ 1 ו perfuse בלב מבודד עם פתרון בידוד מראש התחמם מחומצן במשך 10 דקות (שיעור זלוף: 12-14 מ"ל / דקה). כבה את השסתום על אל"מ 1, להפעיל את השסתום על אל"מ 2 ו perfuse את הלב עם פתרון collagenase 1 עבור 8 - 10 דקות.
6. לרדת בלב מתעכל על ידי חיתוך אבי העורקים ולהעביר אותו על ידי לחיצה על אבי העורקים עם מלקחיים לתוך הבקבוק המכיל פתרון בידוד טריים (איור 1Bi). השתמש במספריים בסדר מלקחיים לחתוך את רוב הקיר בחינם LV (כולל מחצה) לחתיכות קטנות יותר (~ 22 מ"מ, איור 1Bii).
7. מעבירים את חתיכות לתוך בקבוק המכיל תמיסת collagenase טרי מראש התחמם מחומצן 2 (איור 1Biii). Shake למשך 10 דקות. שמור אספקת חמצן פתרון collagenase המכיל myocyte 2.
8. הזז את myocyte - ההשעיה לצינור 10 מ"ל צנטריפוגות באמצעות טפטפות עם נורת שאיבה ולהוסיף Ca ^{2 +} - המכיל פתרון BSA (1: 1 בנפח). צנטריפוגה ב 30 גרם במשך 2 דקות וזורקים supernatant. Re- להשעות גלולה myocyte ב 5 מ"ל של תמיסת BSA. צנטריפוגה וזורקים supernatant.
9. לפזר את כדורי myocyte ולשמור מיוציטים ב 10 מ"ל של פתרון האחסון מראש מחומצן ב RT (איור 1Biv-vi).
10. חזור על נהלים (שלבים 3.7 - 3.9) עם רקמות LV שנותרו בבקבוק.
    הערה: המשך לחזור ההליכים (שלבים 3.7 - 3.9) שוב עד שרוב רקמות LV נעלמת להשיג תשואה טובה של מיוציטים.
11. שמור את מיוציטים בתמיסה אחסון במשך 6-8 שעות ב RT עד תום הניסויים.

4. מדידות סימולטני של הארעית ²⁺ Ca התאי Myocyte התכווצות

1. מיוציטים LV טען עם אסתר acetoxymethyl פורעה -2 AM (2 מיקרומטר).
   הערה: בצע את כל נהלי העמסת ניסויים עם מיוציטים טעונים בתוך שפופרת כהה (האיור 1Bvii).
   1. centrifuge ההשעיה myocyte (1 מ"ל) XG ב 2000 במשך 10 שניות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה myocyte ב 1 מ"ל של תמיסת Tyrode עם ריכוז נמוך Ca ^{2 +} (250 מיקרומטר, לוח חומרים וציוד).
   2. להוסיף פורעה-02:00 ו poloxamer 407 (2 μl), בעדינות לפיזור ההשעיה myocyte, ולשמור את התערובת ב RT (20 - 24 ^מעלות צלסיוס) במשך 15 דקות (איור 1Bvii).
   3. צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות, לבטל את supernatant לפזר את גלולה myocyte ב 1 מ"ל של תמיסת זלוף המכיל 500 מיקרומטר Ca ^{2 +.} לאחר 10 דקות, צנטריפוגה את התערובת במשך 5 שניות וזורקים supernatant.
   4. הוסף פתרון זלוף טריים (500 מיקרומטר Ca ^{2 +,} 1 מ"ל) ולשמור את פורעה-02:00 - גלולה myocyte טעון בפתרון זה עבור הקלטות.
2. מדידה של התכווצות myocyte LV ו- CA התאי ²⁺
   1. לפני ההקלטה, למלא את הצינור זלוף שיוצא דרךז'קט מים עם פתרון Tyrode, שהוא מחומם מראש ל 36 ^מעלות צלסיוס
   2. מניחים כמה טיפות של AM 2 פורעה - השעיה myocyte LV טעון על החדר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה במשך 5 - דקות 8. לאט perfuse הפתרון Tyrode (2.2 mL / min).
   3. לחץ על כפתור "התחל" על הפנל הקדמי של הממריץ הדיגיטלי להתחיל גירוי שדה (2 הרץ).
      הערה: מתח המוצא (10 V, 5 msec משך) מוחלים על מיוציטים בתא באמצעות חוטי פלטינה ממוקמים משני צדי האולם.
      1. מיוציטים בוחר שחוזה ביציבות (לא אלה מוצגים פיגמנטציית-יתר או התכווצות היפו) להקלטה.
   4. התאם את myocyte של בחירה במצב האופקי של מערכת זיהוי מבוסס וידאו sarcomere ולהתאים את הפוקוס של המיקרוסקופ כדי להשיג תמונות אופטימליות של סרקומר. מקם את הקופסה המלבנית הסגולה על האזור שבו סרקומר ברור הם נצפו בבירור עד לממוצעבאורכי sarcomere (שיא אדום) מציג פסגה חדה יחידה (איור 2 א, תמונה תחתונה).
   5. רשום את השינויים באורך sarcomere בתגובה לגירוי שדה (איור 2 א 'וב').
      הערה: השתמש מיוציטים טעונים בתוך 1 - 2 שעות.
   6. התאם את הצמצם של המצלמה כך שהשדה במערכת זיהוי sarcomere וידאו מבוסס הוא בגודל של (איור 2 א) myocyte. לעורר את myocyte עם עירור ב 360 ננומטר / 380 ננומטר פליטה ב 510 ננומטר (תדירות הרכישה 1,000 הרץ). קיצור sarcomere שיא ויחס AM Fura2 עם גירוי שדה (תרשים 2B).

5. הערכת רגישות ²⁺ Myofilament Ca

1. ממוצע אורכי sarcomere ו Ca ^{2 +} ארעי ב יציב (10 - 20 עקבות) ואת עלילת לולאת שלב המטוס של יחס פורעה-2 לעומת אורך sarcomere מאותו myocyte (שניהם עם ערך נמדדשינויים של ודלתה; איור 2 ג).
2. בכל עלילה, להגדיר יחס -2 פורעה ב -50 הרפיה% ₍₅₀ EC, איור 2C). השוואת שתי הלולאה ו- EC ₅₀ של כל התערבות.

תוצאות

מיוציטים LV מבודדים לבבות עכברוש נורמלי יתר לחץ דם. רוד בצורה מיוציטים עם פסים ברורים (מייצג סרקומר) ואת צירים יציבים בתגובה לגירוי שדה נחשבים להיות מיוציטים האופטימלי ונבחרים להקלטות (איור 2 א). בדוגמה המוצגת F igure 2A, פורעה 2 לפני הצה?...

Discussion

כאן אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי להעריך את השינויים של רגישות ²⁺ myofilament Ca ב myocyte הלב יחיד מבודד ולהדגיש את החשיבות של מדידת פרמטר זה לצד תכונות אלקטרו, הארעיים Ca ^{2 +} תאיים, ודינמיקה myofilament. הסיבה לכך היא כי ההקלטות של אחד או שניים מהפרמטרים לא יכולות להסביר את...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM