Evaluación de los miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidad cardíaca subyacente excitación-contracción de acoplamiento

Resumen

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Resumen

La insuficiencia cardíaca y arritmias cardíacas son las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. Sin embargo, el mecanismo de la patogénesis y el mal funcionamiento del miocardio en el corazón enfermo aún no ha sido aclarado. Evidencia convincente reciente demuestra que los cambios en la sensibilidad a la myofilament Ca ²⁺ afectan Ca intracelular ²⁺ actividades homeostasis y de los canales iónicos en los miocitos cardiacos, los mecanismos esenciales responsables de potencial de acción cardíaco y la contracción en corazones sanos y enfermos. De hecho, las actividades de los canales iónicos y transportadores subyacentes potenciales de acción cardiacos (por ejemplo, Na ^+, Ca2 ⁺ y canales de K ⁺ y el intercambiador de Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ y Ca ^{2 +} manejo proteínas intracelulares (por ejemplo., Receptores de rianodina y Ca ^{2 +} -ATPasa en retículo sarcoplásmico (SERCA2a) o fosfolamban y su fosforilación) se miden convencionalmente para Evalucomieron los mecanismos fundamentales de acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE). Ambas actividades eléctricas en la membrana y cambios intracelulares de Ca ²⁺ son las señales de disparo de acoplamiento CE, mientras que los miofilamentos es la unidad funcional de la contracción y la relajación, y la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ es imprescindible en la aplicación de los resultados de las miofibrillas. Sin embargo, pocos estudios incorporan sensibilidad myofilament Ca ²⁺ en el análisis funcional del miocardio a menos que sea el foco del estudio. A continuación, se describe un protocolo que mide el acortamiento del sarcómero / re-alargamiento y el nivel intracelular ^de Ca2 ⁺ con Fura-2 de AM (detección radiométrica) y evaluar los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos de corazones de ratas. El objetivo principal es hacer hincapié en que myofilament Ca ^{2 +} sensibilidad debe ser tomado en consideración en el acoplamiento CE para el análisis mecanicista. investigación exhaustiva de ien los canales iónicos, transportadores, manejo intracelular ^de Ca2 ^+, y la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ que subyacen en la contractilidad de los miocitos en corazones sanos y enfermos proporcionará información valiosa para el diseño de estrategias más eficaces de traslación y de valor terapéutico.

Introducción

Acoplamiento excitación-contracción cardiaca (CE) es el esquema fundamental para el análisis de las propiedades mecánicas del miocardio, es decir, la función contráctil del corazón ^1,2. Acoplamiento CE se inicia por despolarización de la membrana secundaria a las actividades de los canales de iones sarcolema (por ejemplo, el canal de Na ⁺ dependiente de voltaje, que se puede medir a través de técnicas de patch-clamp). La posterior activación de voltaje de tipo L de Ca ^{2 +} canales (LTCCs) y Ca ^{2 +} afluencia través LTCCs desencadenar la mayor parte de la liberación ^de Ca2 ⁺ a través de receptores de rianodina (RyRs), el aumento de la concentración citosólica ^de Ca2 ⁺ desde el nanomolar (nM ) a nivel micromolar (M). Este aumento en Ca ²⁺ citosólico promueve Ca ²⁺ unión a la troponina C (TnC) en filamentos delgados y provoca cambios conformacionales del complejo de filamentos para facilitar la interacción actina-miosina y alcanza myocardiAl contracción del ^3. Por el contrario, la citosólica de Ca ²⁺ se re-especialmente captado de nuevo en el retículo sarcoplásmico (SR) a través de la Ca2 ⁺ -ATPasa en SR (SERCA2a) o se extruye fuera de la miocitos a través del intercambiador Na ^{+ 2 +} / Ca y el plasmalemmal Ca ^{2 +} ATPasa ^1,2. En consecuencia, la disminución de Ca ²⁺ citosólico instiga a cambios conformacionales de filamentos delgados de nuevo a su estado original, lo que resulta en la disociación de actina-miosina y la relajación de los miocitos ^1-3. En este esquema, la actividad de la SERCA2a se considera generalmente para determinar la velocidad de relajación del miocardio, ya que representa el 70 - 90% de eliminación citosólica ^de Ca2 ⁺ en la mayoría de las células del corazón de mamífero ^1. Como tal, la manipulación anormal ^de Ca2 ⁺ por LTCC, RyR y SERCA2a, etc. ha sido considerado como los principales mecanismos de deterioro de la contractilidad y la relajación en el corazón enfermo ^1-4.

En realidad, citosólica de Ca ²⁺ libre que funciona como el mensajero en cuentas de acoplamiento de la CE de alrededor del 1% del total de Ca ²⁺ intracelular y la mayoría de Ca2 ⁺ está obligado a Ca2 ⁺ intracelular tampones ^5,6. Esto es debido al hecho de que varios ^de Ca ^{2 +} tampones son abundantes en los miocitos cardíacos, por ejemplo, los fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, calmodulina, parvalbúmina, miofibrilla TnC, miosina, SERCA2a, y calsecuestrina en la SR. ^5,6,7. Entre ellos, la SERCA2a y TNC son los predominantes Ca ²⁺ tampones ^5,6,7. Además, Ca ^{2 +} vinculante a sus buffers es un proceso dinámico durante contracción (por ejemplo, 30-50% de Ca ^{2 +} se une a TnC y se disocian de ella durante Ca ^{2 +} transitorios ⁷⁾ y el cambio en el Ca ²⁺ causa adicional de unión "liberar" de Ca2 ⁺ libre en el citosol, los resultados en las alteraciones del Ca2 ⁺ intracelular concentration. En consecuencia, la perturbación del nivel intracelular de Ca2 ⁺ induce movimientos anormales myofilament, que son los precursores de la disfunción contráctil y arritmias ^8,9. Muchos factores (tanto fisiológicas como patológicas) pueden ser las fuentes de modificaciones post-transcripcional de proteínas myofilament, que influyen en myofilament Ca ²⁺ búfer y myofilament Ca ^{2 +} sensibilidad ^8-10. Recientemente, se informó de que las mutaciones en las proteínas myofilament aumentan el Ca2 ⁺ intracelular y la afinidad de unión de manipulación ^de Ca2 ^+, lo que provocó la potenciación dependiente de pausa de Ca ^{2 +} transitorios, la liberación anormal ^de Ca2 ^+, y arritmias ^8. De acuerdo con este concepto, también hemos demostrado que los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ desensibilización en corazones de ratas con hipertensión secundaria a la regulación de la óxido nítrico sintasa neuronal se asocia con diastólica elevada y sistólica niveles ^{de Ca2 +11,} que a su vez, aumenta la vulnerabilidad de la LTCC a Ca ^{2 +} -dependiente de inactivación ^12. Por lo tanto, la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ es un regulador "activa" de la homeostasis intracelular y la función contráctil de los miocitos Ca ^2+. Se ha hecho necesario para analizar las interacciones entre los miofilamentos y Ca ²⁺ manejo de proteínas para la investigación a fondo de los miocitos CE acoplamiento y la función cardiaca.

A continuación, se describe un protocolo que evalúa los cambios en la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos aislados. Análisis exhaustivo de perfil intracelular ^de Ca2 ^+, la sensibilidad y la contracción de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ se desvela los nuevos mecanismos de la mecánica miocárdica subyacente.

Protocolo

El protocolo está de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de la Salud de la ONU (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996). Fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Seúl (aprobación del IACUC no .: SNU-101213-1).

1. Preparación de búfer (Materiales y Equipo de mesa)

1. Preparar 300 ml de solución de aislamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl _2, 3,5; glucosa, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 con NaOH).
2. Preparar 100 ml de solución de almacenamiento fresco en el día del experimento (en mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO ₄ 5; CaCl ₂ 0,2; de sodio-piruvato 5; glucosa 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 con NaOH).
3. Preparar 1 litro de solución de perfusión (en mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MgCl _2, 1; HEPES, 10; glucosa, 5,5; CaCl _2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 con NaOH).
4. Preparar 30 ml de solución de colagenasa 1 mediante la adición de colagenasa (1 mg / ml), la proteasa (0,1 mg / ml), albúmina de suero bovino (BSA, 1.67mg / ml), y Ca ²⁺ (0,05 mM) a 25 ml de aislamiento solución.
5. Preparar 20 ml de solución de colagenasa 2 mediante la adición de colagenasa (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), y Ca ²⁺ (0,05 mM) a 16,7 ml de solución de aislamiento.
6. Preparar 40 ml de solución de BSA mediante la adición de 0,4 g de BSA a 40 ml de solución de aislamiento. Separada 10 ml y 30 ml en dos vasos de precipitados. Añadir Ca ^{2 +} a 30 ml de solución de BSA de modo que la concentración final ^de Ca2 ⁺ en la solución de BSA es de 1 mM.

2. Preparación para el aislamiento de miocitos ventriculares izquierda (LV)

1. Transferir 8-12 ratas semanas de edad, macho Sprague-Dawley (SD) en jaulas de transporte no contaminantes de las instalaciones de animales a la sala de preparación y aislamiento.
2. MARIDOcomer dos baños de agua a 37 ^° C.
   Nota: Utilice un baño de agua para el agua - depósito con camisa y los tubos de perfusión del sistema de perfusión Langendorff. Utilice el otro baño de agua para agitar troncos de tejido miocárdico con el fin de separar los miocitos individuales.
3. Añadir 5 ml y 3,3 ml de solución de BSA (sin Ca ^{2 +)} a 25 ml de solución de colagenasa 1 y 16,7 ml de solución de colagenasa 2 para compensar el volumen a 30 ml y 20 ml, respectivamente.
4. Añadir solución de aislamiento (100 ml) y solución de colagenasa 1 (30 ml) a la columna 1 (Col. 1) y la columna 2 (Col. 2) en el sistema de perfusión de Langendorff, respectivamente (Figura 1A).
5. Oxigenar la solución de aislamiento y solución de colagenasa 1 en Col. 1 y Col. 2 a través del tubo de conexión de oxígeno en el sistema de perfusión Langendorff (Figura 1A). Del mismo modo, la solución de colagenasa de compuestos oxigenados 2 y la solución de BSA en el baño de agua en agitación con 100% de O ₂ a través de latubo de conexión de oxígeno.

3. Aislamiento de miocitos LV

1. Anestesiar una rata SD a través de inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) y confirmar el estado anestésico por toe pellizcos y la falta de retirada reflexión.
2. Mover la rata a una bandeja de disección. En la posición de decúbito supino, asegurar las cuatro patas a los lados del cuerpo con cinta adhesiva.
3. Aplicar incisiones axiales mediados de torácicos con tijeras quirúrgicas para abrir el pecho, asegurando de no dañar el corazón. Utilice otro par de tijeras limpias para diseccionar el corazón de los vasos de conexión (por ejemplo, superior e inferior vena cava, vasos pulmonares y aorta) y la membrana pericárdica ^13.
4. Dejar una porción de la aorta de una longitud suficiente (5-8 mm), sujetar la aorta con unas pinzas finas, y montar rápidamente la cánula del sistema de perfusión Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Ate hilo de sutura 4/0 firmemente sobre la aorta.
5. Activar la válvula en Col. 1 y perfundir el corazón aislado con la solución de aislamiento pre-calentado y oxigenada durante 10 minutos (tasa de perfusión: 12-14 ml / min). Cierre la válvula en la Col. 1, encienda la válvula en Col. 2 y perfundir el corazón con una solución de colagenasa 1 durante 8 - 10 minutos a.
6. Desmontar el corazón digerido mediante la reducción de la aorta y la transfiere mediante la celebración de la aorta con una pinza en el matraz que contenía solución de aislamiento fresco (Figura 1Bi). Utilice unas tijeras finas y pinzas para cortar la mayor parte de la pared libre del VI (incluyendo el septo) en trozos más pequeños (~ 22 mm, la figura 1Bii).
7. Transferir las piezas en un matraz que contenía colagenasa solución fresca caliente previamente oxigenada 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Mantenga la entrega de oxígeno a la solución de colagenasa que contiene miocitos-2.
8. Mueva el miocito - suspensión a un tubo de centrífuga de 10 ml usando goteros con una pera de succión y añadir Ca ²⁺ - que contiene solución de BSA (1: 1 en volumen). Centrifugar a 30 g durante 2 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento de los miocitos en 5 ml de solución de BSA. Centrífuga y desechar el sobrenadante.
9. Dispersar los gránulos de miocitos y mantener miocitos en 10 ml de solución de almacenamiento de pre-oxigenada a TA (Figura 1Biv-vi).
10. Repita los procedimientos (pasos 3.7 a 3.9) con el tejido LV restante en el matraz.
    Nota: Mantenga la repetición de los procedimientos (pasos 3.7 a 3.9) de nuevo hasta que la mayoría del tejido LV desaparece para obtener un buen rendimiento de los miocitos.
11. Mantener los miocitos en solución de almacenamiento para 6-8 horas a RT hasta que el final de los experimentos.

4. Las mediciones simultáneas de Ca2 ⁺ intracelular transitorios y miocitos Contracción

1. miocitos carga de voltaje con el éster de acetoximetilo Fura-2 de AM (2 M).
   Nota: Realizar todos los procedimientos de carga y experimentos con miocitos cargados en un tubo oscuro (Figura 1Bvii).
   1. Centrifuge la suspensión de miocitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento de los miocitos en 1 ml de solución de Tyrode con una baja concentración ^de Ca2 ⁺ (250 mM, Materiales y Equipos de mesa).
   2. Añadir Fura-2AM y poloxámero 407 (2 l), se dispersan suavemente la suspensión de miocitos, y mantener la mezcla a temperatura ambiente de (20 - ^24º C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii).
   3. Se centrifuga la mezcla durante 5 seg, desechar el sobrenadante y dispersar el sedimento de los miocitos en 1 ml de solución de perfusión que contiene 500 mM ^de Ca2 ^+. Después de 10 min, se centrifuga la mezcla durante 5 seg y descartar el sobrenadante.
   4. Añadir solución de perfusión fresco (500 mM Ca ^{2 +,} 1 ml) y mantener el Fura-2AM - pellet miocitos cargado en esta solución para grabaciones.
2. Medición de la contracción de los miocitos LV y Ca2 ⁺ intracelular
   1. Antes de grabar, llenar el tubo de perfusión que se ejecuta a través de unacamisa de agua con la solución de Tyrode, que es pre-calienta a 36 ^° C
   2. Coloque unas pocas gotas de la Fura 02 a.m. - cargado suspensión de miocitos LV en la cámara de un microscopio de fluorescencia invertido durante 5 - 8 minutos. perfundir lentamente la solución de Tyrode (2.2 ml / min).
   3. Presione el botón "Inicio" en el panel frontal del estimulador digital para iniciar la estimulación de campo (2 Hz).
      Nota: El voltaje de salida (10 V, 5 ms de duración) se aplica a los miocitos en la cámara a través de hilos de platino colocados a cada lado de la cámara.
      1. Seleccione los miocitos que se contraen de manera estable (no se presentan los hiper o hipo-contracción) para la grabación.
   4. Ajuste el miocitos de elección en la posición horizontal del sarcómero sistema de detección basado en vídeo y ajustar el enfoque del microscopio para obtener imágenes óptimas de sarcómeros. Coloque la caja rectangular de color púrpura en la zona en que sarcómeros claras están claramente observadas hasta que el promediode longitud del sarcómero (pico rojo) muestra un pico agudo singular (Figura 2A, la imagen inferior).
   5. Registrar los cambios en la longitud del sarcómero en respuesta a la estimulación de campo (Figura 2 A y B).
      Nota: Utilice los miocitos cargados dentro de 1 - 2 horas.
   6. Ajuste de la abertura de la cámara de manera que el campo en el sistema de detección de sarcómero basado en vídeo es el tamaño del miocito (Figura 2A). Estimular el miocito con excitación a 360 nm / 380 nm y emisión a 510 nm (frecuencia de adquisición 1000 Hz). Grabar el acortamiento del sarcómero y la relación Fura2 AM con la estimulación de campo (Figura 2B).

5. Evaluación de la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺

1. Se promedian las longitudes del sarcómero y Ca ^{2 +} transitorios en estado estacionario (10 - 20 restos) y trazar el bucle de fase plana de la relación de Fura-2 frente a la longitud del sarcómero de la misma miocitos (ambos con valor medidos y delta cambios; Figura 2C).
2. En cada parcela, definir la relación Fura -2 a 50% de relajación (CE _50, Figura 2C). Comparar tanto el bucle y CE ₅₀ de cada intervención.

Resultados

miocitos LV están aisladas de corazones normales e hipertensos de rata. Miocitos en forma de varilla con estrías claros (que representa sarcómeros) y contracciones estables en respuesta a la estimulación de campo se consideran ser los miocitos óptimas y se seleccionan para las grabaciones (Figura 2A). En el ejemplo mostrado en la FIGURA 2A, un Fura 2 a.m. RESORTE LV miocitos se coloca horizontalmente y la abertura de la cámara se ajusta para que el...

Discusión

A continuación, describimos los protocolos para evaluar los cambios de la sensibilidad de los miofilamentos ^de Ca2 ⁺ en los miocitos cardíacos aislados única y hacemos hincapié en la importancia de medir este parámetro junto con las propiedades electrofisiológicas, intracelular de Ca ^{2 +} transitorios, y la dinámica de los miofilamentos. Esto se debe a las grabaciones de uno o dos de los parámetros no pueden explicar los mecanismos subyacentes de la contracción cardíaca y la rel...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM