Avaliação de miofilamentos Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilidade Subjacente Cardiac excitação-contração acoplamento

Resumo

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Resumo

insuficiência cardíaca e arritmias cardíacas são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. No entanto, o mecanismo de patogênese e mau funcionamento do miocárdio no coração doente continua a ser totalmente esclarecido. Provas convincentes recente demonstra que as mudanças na miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade afetam Ca ²⁺ intracelular atividades homeostase e canais iônicos em miócitos cardíacos, os mecanismos essenciais responsáveis ​​pelo potencial de ação cardíaco e contração em corações saudáveis ​​e doentes. De facto, as actividades dos canais de iões e transportadores subjacentes potenciais de acção cardíaca (por exemplo, Na ^+, Ca ²⁺ e os canais de K ⁺ e Na ⁺ -Ca ²⁺⁾ e proteínas de permutador de Ca ²⁺ intracelular de manuseamento (por exemplo., Os receptores de rianodina e Ca ^{2 +} -ATPase no retículo sarcoplasmático (SERCA2a) ou fosfolambam e a sua fosforilação) são convencionalmente medido para avacomeu os mecanismos fundamentais do acoplamento excitação-contração cardíaca (CE). Ambas as atividades elétricas na membrana e Ca ²⁺ alterações intracelulares são os sinais de disparo de acoplamento CE, enquanto miofilamentos é a unidade funcional de contração e relaxamento, e miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade é imperativo na implementação de desempenho miofibrila. No entanto, poucos estudos incorporar miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade para a análise funcional do miocárdio, a menos que é o foco do estudo. Aqui, descrevemos um protocolo que mede sarcomere encurtamento / re-alongamento eo nível ^{de Ca2 +} intracelular usando Fura-2 AM (detecção ratiometric) e avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca ²⁺ em miócitos cardíacos de corações de ratos. O principal objetivo é enfatizar que miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade deve ser levado em consideração no acoplamento CE para análise mecanicista. investigação detalhada do iem canais, transportadores iônicos, intracelular de manipulação ^{de Ca2 +,} e miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade que fundamentam a contratilidade dos miócitos em corações saudáveis ​​e doentes irá fornecer informações valiosas para a concepção de estratégias mais eficazes de translação e valor terapêutico.

Introdução

Acoplamento de excitação-contracção cardíaca (CE) é o esquema fundamental para analisar as propriedades mecânicas do miocárdio, ou seja, a função contráctil do coração ^1,2. CE de acoplamento é iniciado pela despolarização da membrana secundária para as actividades dos canais de iões de sarcolema (por exemplo, a voltagem-canal de Na ^+, que pode ser medido através de técnicas de patch-clamp). Activação subsequente do tipo L dependentes da voltagem canais de ^{Ca2 +} (LTCCs) e influxo de ^{Ca2 +} através LTCCs desencadear a grandes quantidades de libertação ^{de Ca2 +} através dos receptores de rianodina (RyRs), aumentando a concentração citosólica ^{de Ca2 +} a partir do nanomolar (nM ) a micromolar nível (^ M). Um tal aumento no Ca ²⁺ citosólica ^{de Ca2 +} promove a ligação à troponina C (TNC) em filamentos finos e induz alterações conformacionais do complexo filamento para facilitar a interacção actina-miosina e alcança myocardial contração ^3. Por outro lado, o ^{Ca2 +} citosólico é re-captado volta para o retículo sarcoplasmático (RS) através da ^{Ca2 +} -ATPase em SR (SERCA2a) ou é extrudada para fora do miócito através do Na ⁺ / ^{Ca2 +} e o permutador de plasmalemmal ^{Ca2 +} ATPase ^1,2. Consequentemente, o declínio no Ca ²⁺ citosólico instiga mudanças conformacionais de filamentos finos de volta ao estado original, resultando na dissociação da actina-miosina e miócitos relaxamento ^1-3. Neste esquema, a actividade da SERCA2a é geralmente considerada para determinar a velocidade de relaxamento do miocárdio porque é responsável por 70 - 90% de remoção citosólica ^{de Ca2 +} na maioria das células de mamífero do coração ^1. Como tal, anormal manipulação de Ca ²⁺ por LTCC, RyR e SERCA2a, etc. tem sido considerado os mecanismos principais para comprometimento da contratilidade e relaxamento no coração doente ^1-4.

Na realidade, livre citosólica ^{de Ca2 +,} que funciona como o mensageiro em contas de acoplamento CE para cerca de 1% do total de Ca ²⁺ e a maioria dos Ca ²⁺ é obrigado a intracelulares ^{de Ca2 +} buffers ^5,6. Isto é devido ao facto de vários tampões Ca ²⁺ são abundantes em miócitos cardíacos, por exemplo, fosfolípidos de membrana, ATP, fosfocreatina, a calmodulina, a parvalbumina, miofibrila TnC, miosina, SERCA2a, e calsequestrin no SR. ^5,6,7. Entre eles, SERCA2a e TnC são as predominantes Ca ²⁺ buffers ^5,6,7. Além disso, o Ca ²⁺ ligação aos seus tampões é um processo dinâmico durante tique (por exemplo, 30-50% de Ca ²⁺ se liga a TnC e dissociam-se que durante os transientes ^{de Ca2 + 7)} e a alteração no Ca ²⁺ causa adicional de ligação "libertação" de ^{Ca2 +} livre para o citosol, os resultados nas alterações do ^{Ca2 +} intracelular concentration. Consequentemente, a perturbação do nível intracelular de Ca ²⁺ induz movimentos miofilamentos anormais, que são os precursores da disfunção contráctil e arritmias ^8,9. Muitos factores (tanto fisiológicos e patológicos) podem ser as fontes de modificações pós-transcricionais de proteínas miofilamentos, que influenciam miofilamentos Ca ²⁺ e de tamponamento miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade ^8-10. Recentemente, foi relatado que mutações em proteínas miofilamentos aumentar o ^{Ca2 +} intracelular e a afinidade de ligação a manipulação ^{de Ca2 +,} desencadeando a potenciação dependente de pausa de transientes ^{de Ca2 +, Ca2 +,} libertação anormal e arritmias ^8. De acordo com este conceito, mostrámos também que miofilamentos Ca ²⁺ dessensibilização em corações de ratos hipertensos secundárias à sobre-regulação da sintase do óxido nítrico neuronal está associada com elevada diastólica e sistólica Ca ²⁺ níveis^11, que por sua vez, aumenta a vulnerabilidade do LTCC ao ^{Ca2 +} inactivação dependente ^12. Assim, miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade é um regulador "ativo" da função contrátil intracelular ^{de Ca2 +} homeostase e miócitos. Tornou-se necessário analisar as interacções entre miofilamentos e Ca ²⁺ manipulação proteínas para investigação aprofundada sobre miócitos acoplamento CE e função cardíaca.

Aqui, descrevemos um protocolo que avalia as mudanças de miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade em miócitos cardíacos isolados. Análise abrangente do intracelular perfil Ca ^2+, miofilamentos Ca ²⁺ sensibilidade e contração vai descobrir novos mecanismos mecânicos do miocárdio subjacentes.

Protocolo

O protocolo está de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicados pelos Institutos Nacionais da ONU de Saúde (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996). Foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade Nacional de Seul (aprovação IACUC no .: SNU-101213-1).

1. Tampão de Preparação (Materiais de mesa e equipamentos)

1. Preparar 300 ml de solução de isolamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; _MgCl2, 3,5; glicose, 5; HEPES, 5; Na ₂ HPO _4, 0,4; taurina, 20; pH 7,4 com NaOH).
2. Preparação de 100 ml de solução de armazenamento de fresco no dia da experiência (em mM: NaCl 120; KCl 5,4; _MgSO4 5; _CaCl2 0,2; de sódio e piruvato 5; glucose 5,5; taurina 20; HEPES 10; manitol 29; pH 7,4 com NaOH).
3. Prepare 1 litro de solução de perfusão (em mM: NaCl, 141,4; KCI, 4; NaH ₂ PO _4, 0,33; MGCL _2, 1; HEPES, 10; glicose, 5,5; _CaCl2, 1,8; manitol, 14,5; pH 7,4 com NaOH).
4. Preparar 30 ml de uma solução de colagenase, adicionando colagenase (1 mg / ml), a protease (0,1 mg / ml), albumina de soro bovino (BSA, 1.67mg / ml), e ^{Ca2 +} (0,05 mM) a 25 ml de isolamento solução.
5. Preparar 20 ml de solução de colagenase 2 por adição de colagenase (1 mg / mL), BSA (1,67 mg / ml), e ^{Ca2 +} (0,05 mM) a 16,7 ml de solução de isolamento.
6. Preparar 40 ml de solução de BSA através da adição de 0,4 g de BSA a 40 ml de solução de isolamento. Separado 10 ml e 30 ml em duas provetas. Adicionar Ca ²⁺ a 30 ml de solução de BSA de modo que a concentração final de ^{Ca2 +} em solução de BSA a 1 mm.

2. Preparação para o isolamento de Left ventricular (LV) miócitos

1. Transferir 8-12, ratos semanas de idade do sexo masculino Sprague-Dawley (SD) em gaiolas de transporte não poluentes do biotério para a sala de preparação e isolamento.
2. Hcomer dois banhos de água a 37 ^o C.
   Nota: Utilize banho de uma água para a água - reservatório encamisado e os tubos de perfusão do sistema de perfusão Langendorff. Use outro banho de água para agitar troncos de tecido do miocárdio, a fim de separar os miócitos individuais.
3. Adicionar 5 ml e 3,3 ml de solução de BSA (sem ^{Ca2 +)} para 25 ml de solução de colagenase 1 e 16,7 ml de solução de colagenase 2 para perfazer o volume para 30 ml e 20 ml, respectivamente.
4. Adicionar solução de isolamento (100 ml) e solução de colagenase 1 (30 ml) a uma coluna (Cl 1) e a coluna 2 (Cl 2) no sistema de perfusão de Langendorff, respectivamente (Figura 1A).
5. Oxigenar a solução de isolamento e uma solução de colagenase em Cl 1 e Cl 2 através do tubo de ligação de oxigénio no sistema de perfusão de Langendorff (Figura 1A). Da mesma forma, a solução de colagenase oxigenado 2 e a solução de BSA no banho de água com agitação, com 100% de _O2 através datubo de ligação de oxigênio.

3. Isolamento de LV miócitos

1. Anestesiar uma ratazana SD por meio de injecção intraperitoneal de pentobarbital sódico (30 mg / kg) e confirmar o estado anestésico por dedo do pé que comprime e falta de retirada reflexão.
2. Mova o rato para uma bandeja de dissecação. Na posição supina, fixe as quatro pernas para os lados do corpo com fita.
3. Aplicar incisões mid-axiais com tesouras cirúrgicas torácicas para abrir a caixa, garantindo a não danificar o coração. Use um outro par de tesouras limpas para dissecar o coração dos vasos comunicantes (por exemplo, superior e inferior da veia cava, vasos pulmonares e aorta) e membrana de pericárdio ^13.
4. Deixar uma porção da aorta de um comprimento suficiente (5-8 mm), prender a aorta, com uma pinça fina e montar rapidamente a cânula do sistema de perfusão de Langendorff dentro de 1 min (Figura 1A). Amarre fio de sutura 4/0 firmemente sobre a aorta.
5. Ligar a válvula em Col. 1 e perfundir o coração isolado com uma solução de isolamento pré-aquecido e oxigenado durante 10 min (taxa de perfusão: 12-14 mL / min). Desligue a válvula na Col. 1, acender a válvula na Col. 2 e perfundir o coração com solução de colagenase 1 para 8-10 min.
6. Desmontar o coração digerido por corte da aorta e transferi-lo, mantendo a aorta com uma pinça para o balão contendo uma solução de isolamento fresco (Figura 1bi). Use uma tesoura fina e pinças para cortar a maior parte de parede livre do VE (incluindo o septo) em pedaços menores (~ 22 mm, Figura 1Bii).
7. Transferir os pedaços para um frasco contendo uma solução de colagenase fresco pré-aquecido e oxigenado 2 (Figura 1Biii). Agitar durante 10 min. Manter a entrega de oxigênio para a solução de colagenase contendo miócitos 2.
8. Mova o miócitos - suspensão para um tubo de 10 ml de centrífuga usando conta-gotas com um bulbo de sucção e adicionar Ca ²⁺ - contendo solução de BSA (1: 1 em volume). Centrifugar a 30 g durante 2 min e desprezar o sobrenadante. Re-suspender o sedimento de miócitos em 5 ml de solução de BSA. Centrífuga e descartar o sobrenadante.
9. Dispersar os peletes de miócitos e manter miócitos em 10 ml de solução de armazenamento de pré-oxigenado à TA (Figura 1Biv-VI).
10. Repita os passos processuais (3,7-3,9) com o tecido do LV restante no frasco.
    Nota: Manter repetindo os procedimentos (passos 3,7-3,9) novamente até que a maior parte do tecido do LV desaparece para se obter um bom rendimento de miócitos.
11. Manter os miócitos em solução de armazenamento para 6-8 horas a temperatura ambiente, até ao fim das experiências.

4. As medições simultâneas de ^{Ca2 +} intracelular Transitórios e miócitos Contração

1. miócitos carga LV com o éster de acetoximetilo de Fura-2 AM (2 | iM).
   Nota: Execute todos os procedimentos de carga e experiências com miócitos carregados em um tubo escuro (Figura 1Bvii).
   1. Centrifuge a suspensão de miócitos (1 ml) a 2000 xg durante 10 seg. Descartar o sobrenadante e re-suspender o pellet de miócitos em 1 ml de solução de Tyrode com uma baixa concentração ^{de Ca2 +} (250? M, Materiais de mesa e equipamentos).
   2. Adicionar Fura-02:00 e poloxamer 407 (2 mL), suavemente dispersar a suspensão de miócitos, e manter a mistura temperatura ambiente (20-24 ^° C) durante 15 minutos (Figura 1Bvii).
   3. Centrífuga-se a mistura durante 5 seg, descartar o sobrenadante e dispersar o sedimento de miócitos em 1 ml de solução de perfusão contendo 500 uM de Ca ^2+. Depois de 10 minutos, centrifugar a mistura durante 5 seg e desprezar o sobrenadante.
   4. Adicionar solução de perfusão fresco (500 | iM ^{de Ca2 +,} 1 ml) e manter o Fura-02:00 - sedimento miócito carregado nesta solução de gravação.
2. A medição da contracção dos miócitos e ^{Ca2 +} intracelular
   1. Antes de gravar, encher o tubo de perfusão que é executado através de umacamisa de água com a solução de Tyrode, que é pré-aquecido a 36 ^o C.
   2. Coloque algumas gotas do Fura 02:00 - carregado suspensão de miócitos LV na câmara de um microscópio de fluorescência invertido para 5-8 min. Lentamente perfundir a solução de Tyrode (2,2 ml / min).
   3. Pressione o botão "start" no painel frontal do estimulador digital para iniciar a estimulação de campo (2 Hz).
      Nota: A tensão de saída (10 V, 5 mseg de duração) é aplicado aos miócitos na câmara por meio de fios de platina posicionados em ambos os lados da câmara.
      1. Seleccione miócitos que se contraem de forma estável (não aqueles que apresentam hiper ou hipo-contração) para a gravação.
   4. Ajuste do miócito de escolha na posição horizontal do sistema de detecção à base de sarcómero vídeo e ajustar a focagem do microscópio, para obter imagens óptimas de sarcómeros. Posicionar a caixa retangular roxo na área em que sarcômeros claras são claramente observados até a médiade comprimentos de sarcômero (pico vermelho) mostra um pico singular afiada (Figura 2A, imagem inferior).
   5. Gravar as mudanças de comprimento do sarcómero em resposta à estimulação do campo (Figura 2A e B).
      Nota: Use os miócitos carregados dentro de 1 - 2 horas.
   6. Ajustar a abertura da câmara de modo a que o campo no sistema de detecção à base de sarcómero vídeo é o tamanho do miócito (Figura 2A). Estimular a miócitos com excitação a 360 nm / 380 nm e emissão a 510 nm (freqüência de aquisição de 1.000 Hz). Encurtamento do sarcômero Record e a relação Fura2 AM com estimulação de campo (Figura 2B).

5. Avaliação de miofilamentos ^{Ca2 +} Sensibilidade

1. Calcular a média dos comprimentos de sarcômero e Ca ^{2 +} transientes no estado estacionário (10 - 20 traços) e traçar o ciclo do plano de fase da relação de Fura-2 vs. comprimento do sarcômero do mesmo miócitos (ambos com valor medidos e delta mudanças; Figura 2c).
2. Em cada parcela, definir rácio Fura -2 a 50% de relaxamento _(EC50, Figura 2C). Compare tanto o loop e EC ₅₀ de cada intervenção.

Resultados

miócitos do VE são isolados de corações normais e hipertensos ratos. Miócitos em forma de haste com estrias claras (representando sarcómeros) e contracções estáveis ​​em resposta à estimulação do campo são considerados os miócitos óptimos e são seleccionados para gravações (Figura 2A). No exemplo mostrado na F igura 2A, uma Fura 02:00 -loaded miócitos está posicionado horizontalmente e a abertura da câmara é ajustado de modo que...

Discussão

Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar as alterações de sensibilidade dos miofilamentos Ca ²⁺ em um único miócitos cardíacos isolados e enfatizar a importância de se medir este parâmetro juntamente com propriedades eletrofisiológicas, intracelulares ^{de Ca2 +} transientes, ea dinâmica dos miofilamentos. Isto é porque as gravações de um ou dois dos parâmetros não podem explicar os mecanismos subjacentes a contracção cardíaca e relaxamento. Ao contrário dos métodos convencionai...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM