Myofilament 칼슘의 평가<sup&gt; 2 +</sup&gt; 감도 근본적인 심장 여진 수축 커플 링

요약

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca²⁺ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca²⁺ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

초록

심부전 및 심장 부정맥은 전 세계적으로 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 그러나, 병에 걸린 마음의 병인과 심근 고장의 메커니즘은 완전히 명확 일이다. 최근 강력한 증거가 myofilament 칼슘 2 ⁺ 감도의 변화가 심장 근육 세포에서 세포 내 ^칼슘 항상성 및 이온 채널 활동에 영향을 미칠 것으로 보여, 건강하고 병에 걸린 마음에 심장 활동 전위과 수축을 담당하는 핵심 메커니즘. 사실, (예를 들어, 나 ^+, 칼슘 2 ^+와 K ⁺ 채널과 나 ⁺ -ca ²⁺ 기) 및 세포 내 칼슘 2 ⁺ 처리 단백질 (예., ryanodine 수용체와 칼슘을 심장 활동 전위를 기본 이온 채널의 활동 및 운송 근질 세망 (SERCA2a) 또는 phospholamban과 인산화)에서 ^{2 +} -ATPase 종래 evalu 측정된다심장 자극 - 수축 (EC) 커플 링의 기본 메커니즘을 먹었다. myofilament이 수축과 이완의 기능 부이고, myofilament ^칼슘 감도 근원 섬유 성능의 구현에 필수적인 반면, 멤브레인 및 세포 내 ^칼슘의 변화 모두 전기 활동은 EC 결합의 트리거 신호이다. 이 연구의 초점이 아닌 그럼에도 불구하고, 몇몇 연구는 심근의 기능 분석에 myofilament ^칼슘 감도를 통합합니다. 여기, 우리는 근절 단축 / 재 연장과의 Fura-오전 2시 (비율 계량 감지)와 쥐 마음에서 심장 근육 세포에 myofilament ^칼슘 감도의 변화를 평가를 사용하여 세포 내 ^칼슘 수준을 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 주요 목적은 ^칼슘 감도 역학적 분석 EC 결합에서 고려되어야한다는 myofilament을 강조하는 것이다. 난의 종합 조사번역 및 치료 가치보다 효과적인 전략을 설계에 대한 유용한 정보를 제공 할 것이다 건강하고 병에 걸린 마음에서 심근 수축력의 기초 채널, 이온 수송, 세포 내 ^칼슘 처리 및 myofilament ^칼슘 감도에.

서문

여기 심장 수축 (EC) 결합 심근 즉, 심장의 수축 ^1,2- 함수의 기계적 특성을 분석하는 기본 방식이다. EC 커플 sarcolemmal이 이온 채널의 활성에 보조 막을 탈분극에 의해 개시된다 (예를 들어, 패치 클램프 기술을 통해 측정 할 수있는 전압 - 게이트 나 ^{+ 채널).} (나노 몰에서 nm의 세포질 ^칼슘 농도를 증가 ryanodine 수용체 (RyRs)를 통해 전압 게이트 L 형의 후속 활성화 칼슘은 ^{2 +} 채널 LTCCs를 통해 ²⁺ 유입이 칼슘의 대부분을 트리거 (LTCCs)과 칼슘 2 ⁺ 릴리스, )는 (μM) 수준을 마이크로합니다. 세포질 ^칼슘의 이러한 증가는 얇은 필라멘트에 트로포 닌 C (TNC)에 결합하는 ^{2 +} 칼슘을 촉진하고 이끌어 필라멘트 복합체의 구조적 변화를 액틴 - 미오신 상호 작용을 촉진하고 myocardi을 달성알은 ³ 수축. 반대로, 세포질 ^칼슘은 SR에서 칼슘 2 ⁺ -ATPase를 통해 근질 세망 (SR) (SERCA2a)로 다시 재 uptaken거나 나 ⁺ / ^칼슘 교환기 및 plasmalemmal를 통해 심근에서 압출 칼슘 2 ⁺ ATPase의 ^{1, 2.} 따라서, 세포질 칼슘의 감소는 ^{2 +} 액틴 - 미오신과 심근 이완 ^1-3의 분리의 결과로, 다시 원래 상태로 얇은 필라멘트의 구조적인 변화를 선동. 대부분의 포유 동물의 심장 세포 ¹ 세포질 ^칼슘 제거의 90 % - 이러한 방식에서, SERCA2a의 활성은 일반적으로 70를 차지하기 때문에 심근 완화의 속도를 결정하는데 고려된다. 등 LTCC, RyR 및 SERCA2a에 의해 같은 비정상적인 ^칼슘 처리로 병에 걸린 심장 ^1-4에서 장애인 수축과 이완의 기본 메커니즘을 고려하고있다.

현실에서, ^{2 +} 총 세포 내 칼슘의 약 1 %에 대한 EC 커플 링 계정의 메신저와 ^칼슘의 대부분 같은 기능은 세포 내 칼슘 2 ⁺ 버퍼 ^5,6에 바인딩 무료 세포질 ^칼슘. 이는 다양한 ^칼슘 버퍼의 SR에 예를 들어, 막 인지질, ATP, 크레아틴 인산, 칼 모듈 린, parvalbumin, 근원 섬유 TNC, 미오신, SERCA2a 및 calsequestrin 심장 근육 세포에 풍부 사실이다. ^5,6,7. 그 중, SERCA2a 및 TNC가 지배적 인 칼슘 2 ⁺ 버퍼 ^{5,6,7입니다.} 또한, 칼슘 ^{2 +의} 버퍼 바인딩 트 동안 역동적 인 과정이며, 추가 원인을 결합 칼슘의 변화 ²⁺ (예를 들어, ^{2 +} 칼슘의 30 % ~ 50 %는 ^{2 +} 과도 ⁷ TNC에 결합 칼슘 동안 그것에서 해리) 진한 ²⁺ 세포 내 칼슘의 변화에, 세포질 무료 ^칼슘의 결과를 "해제"entration. 그 결과, 세포 내 ^칼슘 수준의 교란은 수축 기능 장애 및 부정맥 ^8,9의 전구체입니다 이상 myofilament의 움직임을 유도한다. (생리 및 병리 모두) 많은 요인 myofilament ^칼슘 버퍼링 및 myofilament ^칼슘 감도 ^{8-10 영향을} myofilament 단백질의 전사 후 변형의 원천이 될 수 있습니다. 최근에는 칼슘 2 ⁺ 과도, 비정상적인 칼슘 2 ⁺ 릴리스 및 부정맥 ^8의 일시 정지에 의존 증강을 유발, myofilament 단백질의 돌연변이가 ^칼슘 결합 친화 및 세포 내 ^칼슘 처리를 늘리는 것이보고되었다. 이 개념에 맞춰, 우리는 또한 높은 이완기 및 수축기 ^칼슘 수준과 연관된 신경 세포의 산화 질소 합성 효소의 업 규제 이차 고혈압 쥐의 마음이 myofilament ^칼슘 탈감작을 보여 주었다결과적으로, ^칼슘 의존적 불 활성화 ^(12)에 LTCC의 취약성을 증가 ^11. 따라서, myofilament ^칼슘 감도는 세포 내 ^칼슘 항상성 및 심근 수축 기능의 "활성"레귤레이터이다. 그것은 myofilament와 칼슘 사이의 상호 작용을 분석 할 필요가있다 ²⁺ 심근 EC 커플 링 및 심장 기능의 철저한 조사를 위해 단백질을 처리.

여기, 우리는 고립 된 심장 근육 세포에 myofilament ^칼슘 감도의 변화를 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 세포 내 칼슘 2 ⁺ 프로필의 종합 분석, myofilament ^칼슘 감도 및 수축 새로운 메커니즘을 기본 심근 역학을 발굴합니다.

프로토콜

프로토콜은 건강의 UN 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라입니다 (NIH 공개 번호 85-23, 1996 개정). 그것은 서울 대학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) (IACUC 승인 번호 : SNU-101213-1)에 의해 승인되었다.

1. 버퍼 준비 (표 재료 및 장비)

1. mm 단위 (실험 당일 신선한 분리 용액 300㎖를 준비 : 염화나트륨, 135의 KCl, 5.4;의 MgCl _2, 3.5, 글루코스, 5; HEPES, 5; 나 ₂ HPO _4, 0.4, 타우린 20] pH가 7.4 NaOH로).
2. 밀리미터에 (실험의 날에 신선한 스토리지 솔루션 100 ml의 준비 : 염화나트륨 (120);의 KCl 5.4, _황산 5, _CaCl2를 0.2, 나트륨 피루 베이트 (5); 5.5 포도당, 타우린 (20), HEPES (10), 만니톨 (29), pH 7.4의 ) NaOH로.
3. 밀리미터의 관류 액 1L (준비 : 염화나트륨, 141.4을, KCl을, 4;의 NaH ₂ PO _4, 0.33; MGC를_L이 1; HEPES, 10; 포도당, 5.5; 염화칼슘 _2, 1.8; 만니톨, 14.5; pH를 NaOH로 7.4).
4. 절연 25 ㎖로 콜라게나 제 (1 ㎎ / ㎖), 프로테아제 (0.1 ㎎ / ㎖), 소 혈청 알부민 (BSA, 1.67mg / ㎖) 및 ^칼슘 (0.05 mm)를 첨가하여 콜라겐 용액 1 30 ㎖를 준비 해결책.
5. 차단 용액을 16.7 ml의 (1 ㎎ / ㎖) BSA (1.67 ㎎ / ㎖), 및 ^칼슘 (0.05 ㎜) 콜라게나 제를 첨가하여 콜라겐 용액이 20 ㎖를 준비한다.
6. 차단 용액을 40 ml의 BSA 0.4 g을 첨가하여 BSA 용액 40 ml를 준비. 10 mL 및 두 개의 비커에 30 ml의 분리. 칼슘을 BSA 용액 ²⁺ 30 mL로 추가되도록 BSA 용액의 최종 ^칼슘 농도가 1 mm이다.

좌심실 (LV) 심근 세포의 분리 2. 준비

1. 준비와 격리 방에 동물 시설에서 깨끗한 전송 케이지 8-12 주령, 수컷 스프 라그 - 돌리 (SD) 쥐를 전송합니다.
2. H37 ^오 C. 두 개의 수조를 먹고
   참고 : 물에 대해 하나의 수조를 사용 - 재킷 저수지와 랑겐 돌프 관류 시스템의 관류 관. 하나의 근육 세포를 분리하기 위해 심근 조직 트렁크를 선동하기 위해 다른 수조를 사용합니다.
3. 각각 30 mL 및 20 ㎖에 볼륨을 만들기 위해 5 ㎖의 콜라겐 액 (1) 및 16.7 ml의 콜라겐 액이 25 ml의에 (칼슘없이 ²⁺⁾ BSA 용액의 3.3 ML을 추가합니다.
4. 랑겐 도르프 재관류에있어서, 각각 (도 1a)에서 분리 용액 (100 mL) 및 1 열 (골 1) 및 열 (2)에 콜라게나 제 용액 1 (30 ㎖) (골 2)를 추가한다.
5. 랑겐 돌프 관류 시스템 (도 1A)의 산소 연결 튜브를 통해 골 1 Col.2의 분리 용액과 콜라겐 용액 1 네이트. 마찬가지로 네이트 콜라게나 제 용액과 두 비아 100 % O _2를 진탕 수욕에서 BSA 용액산소 접속 관.

LV 근육 세포 3. 분리

1. 펜토 바르 비탈 나트륨 (30 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사를 통해 SD 쥐를 마취하고 곤란 발가락과 철수 반사의 부족으로 마취 상태를 확인합니다.
2. 해부 트레이에 쥐를 이동합니다. 앙와위에서 테이프 본체의 측면에 4 개의 다리를 고정.
3. 심장이 손상되지 않도록 보장, 가슴을 열고 수술 가위 흉부 중간 축 절개를 적용합니다. 연결 용기 (예를 들어, 우수하고 하대 정맥, 폐 혈관 및 대동맥) 및 심낭 막 ^{(13)로부터} 심장을 해부 깨끗한 가위의 또 다른 한 쌍을 사용합니다.
4. 충분한 길이의 대동맥의 일부를 남기기 (5-8mm)를 미세 집게로 대동맥 클램프, 빠르게 1 분 (그림 1A) 내에서 랑겐 돌프 관류 시스템의 캐 뉼러를 탑재합니다. 대동맥을 통해 단단히 봉합 나사 4/0을 묶어.
골 1 밸브를 켜고 10 분 동안 예열 및 산소 격리 솔루션 (관류 속도 : 12 ~ 14 ml / 분)와 고립 된 마음을 관류. , 골 ​​1 밸브의 전원을 끄고 골 2의 밸브를 켜고 8 콜라겐 액 (1)와 함께 마음을 관류 - 10 분.
5. 대동맥을 절단하여 소화 마음을 분리하고 신선한 격리 솔루션 (그림 1Bi)를 포함하는 플라스크에 집게로 대동맥을 유지하여 전송할 수 있습니다. 작은 조각 (~ 22mm, 그림 1Bii)에 (격막 포함) LV 무료 벽의 대부분을 잘라 미세 가위와 집게를 사용합니다.
6. 미리 예열 및 산소 신선한 콜라게나 제 용액 (2) (그림 1Biii)를 포함하는 플라스크에 조각을 전송합니다. 10 분 동안 흔들어. 심근 함유 콜라겐 용액 2에 산소를 전달하는 것.
7. (BSA 용액을 함유 - ²⁺ 흡입 전구 적기를 사용하여 10 mL의 원심 분리 튜브에 현탁 및 CA 추가 - 심근 이동1 : 볼륨 1). 2 분 30 g에서 원심 분리하고 상층 액을 버린다. BSA 용액 5 ㎖에 심근 세포 펠렛을 다시 일시. 원심 분리기 뜨는을 버리고.
8. 심근 세포 펠렛을 분산 및 RT (그림 1Biv-VI)에서 미리 산소 저장 용액 10 ml의 근육 세포를 유지.
9. 플라스크에 남아있는 LV 조직으로 - 절차를 (3.9 3.7 단계) 반복합니다.
   좌심실 조직의 대부분이 근육 세포의 좋은 수율을 얻을 사라질 때까지 다시 - (3.9 3.7 단계)의 절차를 반복하십시오 :합니다.
10. 실험이 끝날 때까지 실온에서 6-8 시간 동안 스토리지 솔루션의 근육 세포를 유지합니다.

세포 내 ^칼슘 과도과 심근 수축 4. 동시 측정

1. 아세 톡시 메틸 에스테르의 Fura-오전 2시 (2 μM)와로드 LV의 근육 세포.
   참고 : 어두운 튜브 (그림 1Bvii)에로드 된 근육 세포로 모든 로딩 절차와 실험을 수행합니다.
   1. 하기 Centr10 초 동안 2,000 XG에서 심근 서스펜션 (1 ml)에 ifuge. 뜨는을 취소하고 낮은 ^칼슘 농도 (250 μM, 표 재료 및 장비)와 타이로드 용액 1 ㎖의 심근 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
   2. 부드럽게 심근 세포 현탁액을 분산,은 Fura - 오전 2시 및 폴록 사머 407 (2 μL)를 추가하고, 실온에서 혼합물을 유지 - 15 분 (20 ~ 24 ^O를 C) (그림 1Bvii).
   3. 원심 혼합물을 5 초 동안, 상층 액을 제거하고 500 μM ^{칼슘을 함유하는} 관류 액 1ml에 심근 세포 펠렛을 분산. 10 분 후, 5 초 동안 혼합물을 원심 분리하고 상층 액을 버린다.
   4. 신선한 관류 용액 (500 μM ^칼슘, 1 ml)에 추가하고의 Fura - 오전 2시 유지 - 녹음이 솔루션에로드 된 심근 세포 펠렛을.
2. 좌심실 심근의 수축과 세포 내 칼슘의 측정 ^{2 +}
   1. 기록하기 전에 통해 실행 관류 관을 채우기인 타이로드 용액, 물 재킷 (36) ^오 C.에 미리은 예열
   2. 8 분 - 5 거꾸로 형광 현미경의 챔버에로드 좌심실 심근 서스펜션 - 상기의 Fura 오전 2시의 몇 방울을 배치합니다. 천천히 타이로드 용액 (2.2 ㎖ / 분)를 관류.
   3. 필드 자극 (2 Hz에서) 시작하는 디지털 자극의 전면 패널에있는 "시작"버튼을 누릅니다.
      주 : 출력 전압 (10 V는 5 밀리 초 지속 기간)는 상기 챔버의 양측에 위치하는 백금 와이어를 통해 챔버에서 심근 세포에 적용된다.
      1. 안정적으로 그 계약을 선택 심근 세포 기록 (하이퍼 또는 저자 극성 수축을 표시하지 않는 것).
   4. 비디오 기반 근절 검출 시스템의 수평 위치에서의 선택의 근세포를 조정 근섬유 분절 최적의 이미지를 획득하기 위해 상기 현미경의 초점을 조절한다. 분명 근섬유 분절는 누가 뭐라고해도 평균 때까지 관찰되는 영역에 보라색 사각형 상자를 배치근절 길이 (적색 피크)의 단수 날카로운 피크 (그림 2A, 낮은 이미지)를 표시합니다.
   5. 필드 자극 (도 2A와 B)에 응답하여 근절 길이의 변화를 기록한다.
      주 : 1 내에서로드 된 근육 세포를 사용 - 2 시간.
   6. 비디오 기반 근절 검출 시스템의 필드가 근세포 (도 2A)의 크기가되도록 카메라의 조리개를 조정한다. 510 nm의 (인수 주파수 1000 Hz에서)에서 360 나노 미터 / 380 nm에서 여기 및 방출과 심근을 자극한다. 기록 근절 단축 및 현장 자극 (그림 2B)로 Fura2 AM 비율.

Myofilament ^칼슘 감도 5. 평가

1. 측정 값이 모두 (- (20 추적 10)과 같은 심근의 근절 길이 대의 Fura-2 비율의 위상면 루프를 플롯 근절 길이 및 정상 상태에서 ^{2 +} 과도 칼슘 평균s와 델타의 변화도 2C).
2. 각각의 플롯에서 50 % 완화에서의 Fura -2 비율 (EC _50, 그림 2C)을 정의합니다. 루프 각 개입의 EC ₍₅₀₎ 양을 비교합니다.

결과

LV의 근육 세포는 정상 및 고혈압 쥐의 마음에서 격리됩니다. 필드 자극에 응답 분명 줄무늬 (근섬유 분절을 대표하는) 안정 수축과 막대 모양의 근육 세포가 최적의 근육 세포로 간주하고 녹음 (그림 2A) 선택됩니다. F의 igure 2a에 도시 된 예에서의 Fura 오전 2시 좌심실 심근 수평 위치와 근세포는 기록 필드 최소 배경 영역의 대부분이 포함되어 차?...

토론

여기서 우리는 하나의 고립 된 심장 근세포에 myofilament ^칼슘 감도의 변화를 평가하기 위해 프로토콜을 설명하고이 전기 생리 특성과 함께 매개 변수, 세포 내 칼슘 2 ⁺ 과도 및 myofilament 역학 측정의 중요성을 강조한다. 하나 또는 두 개의 매개 변수의 녹음은 심장의 수축과 이완을 기본 메커니즘을 해명하지 않을 수 있기 때문입니다. 심근의 수축과 세포 내 칼슘 2 ⁺ 프로필 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sprague Dawley rat	Koatech		8-12 weeks
Pentobarbital Sodium	Hanlim Pharmaceutical (Korea)	AHN901	Insurance code:645301220
NaCl	Sigma	S9625
KCl	Sigma	P4504
NaH2PO4	Sigma	S8282
HEPES	Sigma	H3375
Glucose	Sigma	G8270
CaCl2	Biosesang	C2002
MgCl2	Biosesang	M2001
Mannitol	Sigma	M4125
MgSO4	Sigma	M5921
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256
Taurine	Merck	8.08616.1000
Na2HPO4	Sigma	71649
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177
Protease	Sigma	P6911
Fura-2 (AM)	Molecular Probes	F1221
Pluronic F127 20% solution in DMSO	Invitrogen	P3000MP
Shaking Water Bath	Chang Shin Scientific	Model: C-108
IonWizard Softwae Suite	IonOptix Ltd	Experimental Builder	Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes
Myocyte Calcium & Contractility Recording System	IonOptix Ltd
Circulating Water Bath	BS-Tech	BW2-8
Myocyte Fluorescence Microscope	Nikon	DIATPHOTO 200
MyoCam-S Power	IonOptix
Fluorescence & Video Detection	IonOptix	MyoCam-S
CFA300
PMT400
Fluorescence & System Interface	IonOptix	FSI700
Excitation Light Source	IonOptix	mSTEP
High intensity ARC Lamp Power supply	Cairn Reseach
Filter wheel controller	IonOptix	GB/MUS200
Digital Stimulator	Medical Systems Corportion	S-98 Mutimode
Compositions of Experimental Solutions
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 135
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 5
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 3.5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Na2HPO4	Sigma	71649	Concentration (mmol) 0.4
Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 120
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 5.4
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.2
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 29
MgSO4	Sigma	M5921	Concentration (mmol) 5
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	Concentration (mmol) 5
Taurine	Sigma	CB2742654	Concentration (mmol) 20
Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)
NaCl	Sigma	S9625	Concentration (mmol) 141.4
KCl	Sigma	P4504	Concentration (mmol) 4
NaH2PO4	Sigma	S8282	Concentration (mmol) 0.33
HEPES	Sigma	H3375	Concentration (mmol) 10
Glucose	Sigma	G8270	Concentration (mmol) 5.5
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1.8      For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM
MgCl2	Biosesang	M2001	Concentration (mmol) 1
Mannitol	Sigma	M4125	Concentration (mmol) 14.5
Collangenase Solution 1
Isolation Solution (30mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
Protease	Sigma	P6911	Concentration (mmol) 0.1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
Collangenase Solution 2
Isolation Solution (20mL)
Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)			Concentration (mmol) 1.67 mg/mL
Collagenase Type 2	Worthington	LS004177	Concentration (mmol) 1 mg/mL
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 0.05 mM
BSA solution
Isolation Solution (40mL)
Bovine Fetal Albumin	Sigma	A7906	Concentration (mmol) 400 mg
CaCl2	Biosesang	C2002	Concentration (mmol) 1mM