JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Abstract

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-β receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-β2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

Introduction

Specific detection of proteins expressed during embryonic development is required to validate expression profiles obtained by measuring their cognate mRNAs with RT-PCR or in situ hybridization (ISH). This is commonly achieved by a western blot of embryo extracts followed by detection with specific antibodies. However, this approach is hard to apply to proteins that are in very low abundance, or that have properties that hamper their quantitative transfer during their blotting. Betaglycan, also known as the type III transforming growth factor β (TGF-β) receptor (TGFBR3), is an example of these difficulties. TGFBR3 is a part time membrane proteoglycan that binds TGF-β through its core protein1, with notably higher affinity for the isoform TGF-β2, a property that distinguishes it from any other TGF-β binding protein2. TGFBR3 in the zebrafish is expressed from 8 hpf on, reaching a maximum by 72 hpf, as detected by RT-PCR of its mRNA3.

However, despite the availability of a very specific antibody3, every attempt to detect its translated product by western blot proved unsuccessful. Reckoning that TGFBR3's proteoglycan nature, as well as putative low abundance may be accountable for this failure, a detection method, AFLIP, which takes advantage of TGFBR3 high affinity for TGF-β2 was devised. In this method a protein extract from pooled embryos is allowed to specifically bind 125I-labeled TGF-β2 and the receptor-ligand complexes are purified by immunoprecipitation and cross-linked before separation by SDS-PAGE. The migration patterns observed by autoradiography of the gels revealed the presence and nature of the labeled receptor species. This approach combines the ligand specificity of affinity labeling with immunoprecipitation by specific antibodies, increasing detection range, avoiding the inefficient transfer blotting of TGFBR3. Due to its inherent properties, the AFLIP assay is not a quantitative assay but can be used to confidently gauge relative experimental differences in the analyzed receptor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت على الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوان المعملية واستخدام الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك (UNAM)، تحت رقم CICUAL-البروتوكول: FLC40-14. (CICUAL: "COMITE Institucional الفقرة شرم CUIDADO ذ الالتزام بتعميم الخدمات دي لوس Animales دي ابوراتوريو ديل معهد Fisiologìa متنقل، الجامعة الوطنية المستقلة للمكسيك").

1. إعداد استخراج الجنين البروتين

  1. جمع 100-200 الأجنة لكل حالة للمقارنة (morphants مقابل النوع البري) في المرحلة المطلوبة، على سبيل المثال 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF).
  2. مكان الأجنة في أطباق بتري تحتوي على أسماك المياه (انظر الجدول 1) وdechorionate أجنة باستخدام ملقط غرامة الرؤوس يدويا. تجنب استخدام pronase خلال هذه الخطوة (أو أي البروتيني الآخرين في جميع أنحاء بروتوكول) لأنها قد هضم مستقبلات المستهدفة.
  3. مكان الأجنة في أنبوب 1.5 مل microfuge وغسل الأجنة TWالجليد مع حل العازلة 1X الفوسفات (PBS) (انظر الجدول 1).
  4. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة deyolk (انظر الجدول 1).
  5. إطلاق سراح أكثر من صفار قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا (حوالي 30 - 40 مرة) الأجنة في الحل. لمدة 72 HPF و 48 الأجنة HPF استخدام الأزرق والأصفر نصائح ماصة، على التوالي. قد تحتاج إلى خفض قليلا لتجنب تدمير الأجنة نصائح الصفراء. الإفراج صفار ناجحة يمكن التحقق من خلال مراقبة الأجنة تحت المجهر.
  6. جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية.
  7. تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة.
  8. غسل الأجنة مرتين مع 500 العازلة غسل ميكرولتر (انظر الجدول 1) قبل vortexing بلطف على أقل سرعة.
  9. جمع الأجنة عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 15 ثانية.
  10. بدءا من هنا، ومواصلة الإجراء في 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل طاف بعناية باستخدام الماصة.
  12. الأجنة resuspend في 350 ميكرولتر من تحلل العازلة (انظر الجدول 1) والتجانس باستخدام مدقة البلاستيكية.
  13. احتضان الأجنة هي lysed 30 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات مئوية.
  14. هي lysed الطرد المركزي الأجنة في 11000 x ج لمدة 15 دقيقة من أجل إزالة الحطام غير قابلة للذوبان.
  15. نقل مسح طاف باستخدام الماصة لأنبوب جديد.
  16. تحديد البروتين الكلي من قبل برادفورد البروتين فحص 4، أو غيرها من الإجراءات المناسبة. إذا تم استخدام برادفورد مقايسة، نفذ منحنى المعايرة في وجود تركيزات ما يعادل المنظفات يعرض في المخزن المؤقت تحلل، لأنها تتسبب في التقليل من البروتين القياسية 4.

2. الكشف عن البروتين الذاتية مستقبلات

  1. تقارب وصفها ومناعي (كل هذه الخطوات في 4 درجة مئوية)
    1. ضع 400-500 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين في أنبوب 1.5 مل microfuge وتمييع إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر مع العازلة 1 (انظر الجدول 1).
      ملاحظة: من أجل الحصول على 500 ميكروغرام من البروتين الكلي جنين، حوالي 100-200 الأجنة يجب أن تتم معالجتها في البداية. 72 HPF الأجنة تسفر بشكل روتيني ~ 5 ميكروغرام من البروتين الكلي الجنين، وهو ما يكفي لكشف betaglycan.
    2. إضافة إلى حجم ما يكفي من المسمى الأسهم TGF-β2 للوصول إلى تركيز النهائي من 150 م واحتضان مع الإثارة في أنبوب اختبار الروك 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. يجب أن يكون المسمى TGF-β2 قبل بدء AFLIP، مع 125 أنا من طريقة تي الكلورامين كما وصفها Cheifetz وآخرون. 5.
      تنبيه: استخدام وقائية للحد من التعرض أثناء التعامل مع 125 أنا المسمى يجند.
    3. إضافة إلى حجم ما يكفي من الأجسام المضادة غير مخفف ضد مستقبلات الفائدة من أجل التوصل إلى التخفيف 1: 100 وتستمر الحضانة لمدة 2 ساعة أخرى في 4 درجات مئوية (قد تكون حضانة O / N). هذا هو تخفيف الأمثل للمصل رقم 31، وتستخدم في هذه الدراسة، ووصف أماكن أخرى 3، ولكن هذا يتوقف على نوعية علىtibody، قد يكون تخفيف أكبر أو أصغر الأمثل.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من الخرز ملزمة المناعي مناسب (على سبيل المثال، G-البروتين سيفاروز، الذي سبق معايرتها في TNTE ومعلق 1: 5 من حجمه الأصلي في TNTE)، واحتضان لمدة 50 دقيقة مع التحريض على الكرسي الهزاز أنبوب اختبار في 4 درجات C.
    5. استرداد الخرز التي microcentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية.
    6. تجاهل طاف في حاوية القمامة المشعة المناسبة.
    7. غسل حبات IP ثلاث مرات مع 1 مل من غسل العازلة IP (انظر الجدول 1)، قبل vortexing وmicrocentrifugation في 11000 x ج لمدة 20 ثانية في كل مرة.
    8. و resuspend IP-الخرز في 250 ميكرولتر من غسل العازلة IP.
    9. إضافة 1.5 ميكرولتر من disuccinimidyl suberate (مفاجآت صيف دبي، وحلت في DMSO في 10 ملغ / مل). إعداد الحل مفاجآت صيف دبي قبل استخدامه في هذه الخطوة.
    10. احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الإثارة.
    11. من أجل إخماد رد فعل يشابك، إضافة 500 ميكرولتر سغسل العازلة و IP، على أن تستكمل مع ما يكفي من الأسهم تريس الكلورين ودرجة الحموضة 7.4 لتصل إلى 25 ملي تريس الكلورين. المجموعات الأمينية الحرة في تريس التقاط DSS غير المتفاعل.
    12. أجهزة الطرد المركزي في 11000 x ج لمدة 20 ثانية لجمع IP-الخرز وتجاهل طاف.
    13. و resuspend IP-الخرز في 30 ميكرولتر من الحد عازلة Laemmli.
    14. عينات يغلي مدة 5 دقائق في 94 درجة مئوية.
    15. اختياريا، تحليل العينات في عداد جاما باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.
  2. تحليل عينة
    1. العينات تخضع لتغيير طبيعة SDS-PAGE. استخدام بولي أكريلاميد في نسبة ملائمة لكتلة المستقبل وتشغيل هلام تحت الإجراء العادي.
    2. تزج جل في حل تثبيتي (انظر الجدول 1) لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. غسل هلام مع المياه المقطرة لمدة 15 دقيقة.
    4. وضع الجل في ورق الترشيح رطب سابقا، وتغطي مع فيلم ساران التفاف.
    5. هلام الجافة في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. فضح الجل على أفلام ا phosphorimager الأبيضأون في RT O / N.
    7. مسح الشاشة يتعرض باستخدام phosphorimager باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويبين الشكل 1 نتيجة ممثل حصلت مع AFLIP. إشارات في حارة 1 تأتي من 125 I-يجند مرتبطة تساهميا إما إلى الزرد البروتين betaglycan الأساسية (BG الأساسية، تحت علامة كيلو دالتون 150) أو جوهر BG التي تم تجهيزها لشكله بروتيوغليكان عن طريق الحجز من الجليكوسامي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

استخدام البقع الغربية مع الأجسام المضادة المحددة ضد بروتين من الفائدة هو أداة قيمة لدراسة التعبير عنها 7 خلال مرحلة التطور الجنيني. ومع ذلك، لم يكن immunoblotting من البروتينات عالية الغليكوزيلاتي ناجحة للغاية نظرا لنقلهم عدم الكفاءة وضعف ملزم لالنيتروسليلوز أو PVDF ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Gilberto Morales for fish care and maintenance, and Drs. Claudia Rivera and Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) for their help in rabbit immunization. This work was supported by grants from CONACYT 131226 and PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Disuccinimidyl suberate (DSS)ThermoFisher Scientific21555
Protein G Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0618-01
Gel Dryer Model 583 BIO-RAD1651745
Typhoon 9400GE Healthcare Life Sciences63-0055-78
Cobra II Auto gamma counterPackard
Exposure CassetteMolecular Dynamics63-0035-44
NaClJ.T. Baker3624
KClJ.T. Baker3040
Na2HPO4J.T. Baker3828
K2HPO4J.T. Baker3246
CH3OHJ.T. Baker9070
CH3COOHJ.T. Baker9508
HCHOJ.T. Baker2106
SDSSigma-AldrichL4509
EDTASigma-AldrichED
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
CaCl2Sigma-AldrichC3306
NaHCO3Fisher ScientificS233
PMSFSigma-AldrichP7626
Crystal Sea Marine MixMarine Enterprises Internationalhttp://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix

References

  1. López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
  2. Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
  3. Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
  4. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  5. Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
  6. López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  8. Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
  9. Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
  10. Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
  11. Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
  12. Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
  13. Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
  14. Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
  15. Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
  16. Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114 betaglycan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved